前言　　 特发性脊柱侧凸是指一种脊柱的三维畸形,伴有椎体旋转,发病率约为2～3%,至今病因不明。一个好的建模方法对脊柱侧凸的实验研究十分重要,但现有的建模方法存在以下不足:第一,模型的椎体无明显旋转,而人类脊柱侧凸椎体多有明显旋转;第二,模型不能模拟人类的直立姿势,而直立姿势明显影响脊柱侧凸的形成;第三,建模方式中存在对脊柱、脊髓和腺体等组织结构的直接损伤,影响进一步研究。本研究将利用双足鼠模型能模拟人类直立姿势的特点,采用经皮下拴系双足鼠的肩胛下角与髂骨的方法建立脊柱侧凸模型,探讨此方法是否能更好地模拟人类的脊柱侧凸。　　 褪黑素是一种主要由松果体合成的激素。基础研究证实,切除雏鸡、双足鼠或鱼的松果体可产生与人类的特发性脊柱侧凸非常相似的脊柱畸形。但是,腹腔内注射褪黑素或将切除的松果体自身移植是否能阻止这种实验性脊柱侧凸的发生和发展,至今存在争议。一个最新的前瞻性临床研究显示,进行性加重的特发性脊柱侧凸病人血中褪黑素水平明显低于稳定的特发性脊柱侧凸病人,而稳定的特发性脊柱侧凸病人血中褪黑素水平与正常人相似;对于那些褪黑素水平低下的病人,补充褪黑素可在一定程度上阻止其中一部分病人的畸形进展,原因不清。　　 究其原因,我们推测可能与应用褪黑素的剂量有关。目前发现,特发性脊柱侧凸的进展主要发生在骨骼的快速生长期,其畸形程度与骨骼生长能力有一种很好的相关性;特发性脊柱侧凸女孩的身高明显高于年龄和性别匹配的对照组;褪黑素可通过增强成骨细胞的增殖、分化和基质生成,促进骨的生成,但没有直接证据显示褪黑素可抑制成骨细胞增殖。因此,本研究将探讨褪黑素对成骨细胞增殖是否存在浓度依赖性,并阐明其调控机理。　　 材料与方法　　 一、建模方法及动物饲养　　 采用4周龄、体重约70g的雌性Wistar大鼠45只,随机分为三组。采用体积分数10%的水合氯醛腹腔内注射(3ml/kg)麻醉。1组用爱惜康0号不可吸收丝线经皮下进行拴系,拴系左侧肩胛下角和对侧髂骨,程度为原肩胛下角到对侧髂骨距离的85%～95%,使脊柱发生轻度右凸,再建立双足鼠模型。2组采用左侧肩胛下角和同侧髂骨拴系,其余处理与1组完全相同。3组不建立双足鼠模型外,其余处理与1组完全相同。所有大鼠均独立饲养,1组和2组用特制高笼,3组用标准鼠笼。拴系8周,第8周时剪断拴系线,再观察2周。拴系后在皮肤表面可触及拴系线,如拴系失败,重复手术过程。　　 二、测量指标　　 拴系后即刻和术后第2、4、6、8、8’(拴系解除后即刻)、9、10周摄脊柱后前位和侧位数字化X线片。主要评价以下指标:手术时间、术后首次进食时间、手术死亡率、体重、脊柱相对长度、Cobb角、建模死亡率、二次手术率、脊柱侧凸发生率、椎体旋转发生率。　　 三、细胞培养　　 人成骨细胞系hFOB1.19用无酚红的DMEM-F12培养基,填加10%胎牛血清,于37℃和5%CO2条件下培养,在8～11代时用于实验。　　 四、细胞增殖分析　　 细胞以6000个/孔的密度接种到96孔板,24h后将培养基换成含10%胎牛血清和1nM～1mM浓度褪黑素的培养基,培养24h、48h或72h。然后,每孔加入200μl的无血清培养基和20μl的MTT(5mg/ml)孵育4h,在490nm处测OD值。　　 五、细胞活力染色　　 在暴露到1mM浓度褪黑素后,用胰酶消化,使悬浮细胞,用0.4%的台盼蓝染色,在3min内用血细胞计数板分别计数活细胞和死细胞数。　　 六、细胞周期分析　　 细胞暴露到1nM～1mM浓度褪黑素24h后,用胰酶消化,冰冷的PBS洗2次,固定在75%的乙醇中(4℃、2h)。然后,将细胞用PBS洗一次,填加500μl的PI染料在室温染半小时后,取10000个细胞进行流式细胞分析。　　 七、Westernblot　　 用细胞裂解液将细胞在4℃裂解30min,以12000转、4℃离心15min,收集上清。用12%SDS-PAGE胶分离50ug的蛋白;将蛋白在低温下以60v或40v转到PVDF膜上;用5%的脱脂牛奶或牛血清白蛋白封闭2h;根据说明书的指示比例稀释一抗,在4℃孵育过夜。以1:6000或1:8000比例稀释含过氧化物酶的抗小鼠或抗兔的二抗,在室温孵育2h后进行ECL显色,GAPDH作内参。　　 八、实时定量PCR　　 根据生产商的说明,用Trizol试剂提取细胞RNA,用逆转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。用SYBRPremixExTaqTMⅡ试剂盒,在ABIPrism7900HTFastSystem上进行实时定量PCR反应。反应条件如下:95℃、30s;95℃、5s,60℃、30s,40个循环。反应结束后,通过分析融解曲线以证实结果的可靠性。　　 九、免疫共沉淀　　 在细胞暴露到PD98059(50μM)或褪黑素(1mM)24h后,提取细胞蛋白,根据proteinA/Gbeads说明书操作,样品制备好后用westem-blot检测。　　 十、统计学方法　　 采用SPSS16.0统计软件进行统计学处理。有关率的指标用Fisher确切概率法,其余指标均按分组及拴系术后时间进行方差齐性检验,然后行组间或组内单因素方差分析。用线性回归的方法分析拴系后即刻与术后第8’周、拴系后即刻与术后第10周、术后第8’周与术后第10周冠状面Cobb角之间的相关性。用双因素方差分析评价褪黑素剂量、暴露时间或二者交互作用对结果的影响:在随后的亚组分析中,分别采用Dunnett检验和LSD检验分析褪黑素剂量和暴露时间的影响;采用多项式对比进行趋势检验;利用两独立样本t检验或单因素方差分析评价各处理组间的不同。与对照组相比,基因水平的相对定量值在0.5以下或2以上时,被认为有显著性。检验水准a值取双侧0.05。　　 结果　　 一、建模方式的不同没有影响到大鼠术后的恢复和生长发育　　 虽然1组和2组手术时间长,但拴系后再建立双足鼠模型并未影响大鼠术后恢复。三组大鼠在术中及术后6h内均无死亡发生,除手术过程中有少量渗血外,均无出血,表明建立双足鼠模型未增加手术死亡的风险。每次测量时,三组间体重和脊柱相对长度的差异均无统计学意义,表明不同的建模方式未使三组大鼠的生长发育产生不同。　　 二、1组的建模方法能增加脊柱侧后凸的程度和椎体旋转的发生率　　 在术后第8’周至第10周,三组冠状面Cobb角的变化均无统计学意义,表明大鼠的脊柱侧凸程度稳定,模型有效。三组大鼠拴系后即刻与术后第8’周和术后第10周的冠状面C0bb角均无相关性。术后第8’周与术后第10周的冠状面Cobb角之间高度相关。三组的建模死亡率、二次手术率和脊柱侧凸发生率的差异均无统计学意义。1组的椎体旋转发生率大于2组,差异有统计学意义。　　 三、褪黑素不仅促进还能抑制成骨细胞增殖　　 褪黑素诱导了一种剂量依赖性和时问依赖性效应;这种效应与二者的交互作用无关;1mM浓度褪黑素显著抑制了成骨细胞增殖,而1nM～100μM浓度褪黑素促进了成骨细胞增殖;在每个时间点之间均存在显著不同,且随着暴露时间增加表现出一种线性趋势。　　 四、1mM浓度褪黑素没有造成细胞死亡　　 当细胞活力以相对于对照组的百分比表示时,无论在24h、48h或72h,二组间均无显著差异;即使细胞暴露到1mM浓度褪黑素72h,细胞活力仍然是99%。五、1mM浓度褪黑素通过增加G0/G1期和减少G2/M期诱导了细胞周期停滞　　 当细胞暴露到各种浓度褪黑素24h后,1mM浓度褪黑素显著增加了G0/G1期和减少了G2/M期的比例,但没有明显影响到S期;这些变化在细胞同步到G期后更明显。相反,1nM～10μM浓度褪黑素诱导了一种轻微促细胞周期进展的趋势,在G2/M期最为明显,但没有统计学意义。　　 六、1mM浓度褪黑素下调了cyclinD1、CDK4、cyclinB1和CDK1的表达　　 1mM浓度褪黑素显著下调了cyclinD1和CDK4(与G0/G1期进展有关)及cyclinB1和CDKl(与G2/M期进展有关)的表达;对cyclinE、CDK2和cyclinA(与G1/S期转变和S期进展有关)的表达没有影响。　　 七、1mM浓度褪黑素抑制了ERK的磷酸化　　 1mM浓度褪黑素以一种时间依赖性方式显著抑制了ERK的磷酸化,但是没有明显影响p38、JNK和Akt的磷酸化及ERK、p38、JNK和Akt的表达。　　 八、PD98059和1mM浓度褪黑素协同阻断了ERK的激活　　 根据文献报道和我们预实验结果,50μM浓度的PD98059可有效阻断ERK的激活。PD98059(50μM)和褪黑素(1mM)或二者共同作用于细胞24h后(特别在共同作用下),有效地阻断了ERK在成骨细胞中的激活。与PD98059或褪黑素单独作用相比,这种联合作用协同地增强了ERK磷酸化的抑制作用。　　 九、PD98059和1mM浓度褪黑素协同抑制了细胞增殖　　 MTT增殖分析显示,PD98059(甚至在作用1小时后移除)或褪黑素(尤其是在二者联合时)显著地抑制了成骨细胞增殖。这种联合作用协同地增加了抗成骨细胞增殖效应的事实表明,ERK激活的破坏与褪黑素诱导的抗成骨细胞增殖效应密切相关。　　 十、PD98059和1mM浓度褪黑素协同影响了G1和G2/M期分布　　 流式细胞术P1单染分析显示,PD98059或褪黑素(尤其是在二者联合时)显著增加了细胞周期G0/G1期比例,同时减少了细胞周期G2/M期比例,对S期没有明显影响。与PD98059或褪黑素单独作用相比,这种联合作用协同地增加了细胞周期分布的改变,表明ERK激活的阻断与褪黑素介导的G1和G2/M期停滞有关。　　 十一、PD98059和1mM浓度褪黑素协同影响了cyclinD1、CDK4、cyclinB1和CDK1的表达　　 Westernblot和real-timePCR分析显示,PD98059或褪黑素(尤其是在二者联合时)显著减少了这些基因在蛋白和mRNA水平的表达。与PD98059或褪黑素单独作用相比,这种联合协同作用明显造成了这些基因表达的下调,表明ERK激活的阻断与这些基因表达的下调有关。　　 十二、PD98059和1mM浓度褪黑素可抑制p-ERK与G1和G2/M期基因之间的相互作用　　 免疫共沉淀分析显示,在p-ERK和cyclinD1、CDK4、cyclinBl或CDKl之间有一种显著的相互作用,反之亦然,并且这种作用可被褪黑素或PD98059的处理所削弱。　　 结论　　 椎骨的斜向和垂直应力可分别增加椎体旋转的发生和脊柱侧后凸的程度,双足鼠对侧拴系模型能更好地模拟人类的脊柱侧凸。　　 褪黑素对成骨细胞增殖的调节存在浓度依赖性,低浓度时促进,高浓度时抑制,这种作用与cyclinD1和CDK4(与G1期有关)及cyclinB1和CDK4(G2/M期有关)的下调有关。　　 EKK激活的阻断参与了褪黑素诱导的成骨细胞G1和G2/M期停滞,并且这种抑制效应是潜在地通过ERK途径,而不是通过p38、JNK或Akt途径。