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肝细胞肝癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是严重影响人类健康的恶性肿瘤之一,并已成为我国癌症死亡的第二大原因。肝癌形成的过程有一定的规律,其发生发展是多因素、多基因、多阶段的复杂过程,针对其复杂的病理机制的研究已成为肝癌研究的重点、难点和热点。在肝癌的发生发展过程中,多种蛋白分子表达水平发生变化,提示这些分子参与肿瘤的发生发展。Annexins是一类Ca2+依赖的结合磷脂和细胞膜的蛋白质家族,广泛参与调节细胞膜构建和细胞膜物质以及离子跨膜转运;同时Annexins在多种肿瘤进展中表达量及细胞内定位发生改变,参与肿瘤的发生发展。Annexin A4是Annexin家族中的一员,经研究证实Annexin A4在胰腺癌、肾透明细胞癌中表达发生变化,并证实Annexin A4在肿瘤发生发展中发挥重要作用。本实验采用Western Blot技术分析Annexin A4在具有不同转移潜能的人肝癌细胞株中的表达,应用RNA干扰(RNAi)技术,观察靶向沉默肝癌细胞株MHCC97H Annexin A4基因后对细胞周期、凋亡、增殖和黏附行为的影响,并进一步解析其相关机制。第一部分:Annexin A4在不同转移潜能人肝癌细胞株中的表达目的:探讨Annexin A4在不同转移潜能人肝癌细胞株中的表达。方法:采用Western Blot技术分析Annexin A4在不同转移潜能人肝癌细胞株的表达。结果:Annexin A4在低转移潜能肝癌细胞株BEL-7402、SMMC-7721中呈低表达,而在高转移潜能肝癌细胞株97系列中呈高表达。结论:Annexin A4与肝癌细胞株转移潜能呈正相关。第二部分Annexin A4基因RNAi后对人肝癌细胞株MHCC-97H生物学行为的影响目的:探讨Annexin A4基因RNAi后对人肝癌细胞株MHCC-97H生物学行为的影响。方法:体外化学合成2对Annexin A4 siRNA,脂质体Lipofectamine2000转染肝癌细胞株MHCC97H,Western blot和Realtime-qPCR技术检测RNA干扰效率,流式细胞术检测Annexin A4 RNA干扰后对细胞周期和凋亡的影响,CCK-8实验检测对细胞增殖的影响,黏附实验检测对细胞黏附能力的影响结果: Realtime-qPCR和Western Blot结果显示,siRNA在浓度为100nM,干扰时间为48小时可以获得最高干扰效率。细胞行为学实验表明Annexin A4基因沉默后使肝癌细胞增殖活性下降19.06%,黏附能力下降23.19%;而对细胞凋亡和周期影响不大。结论:Annexin A4的表达与人肝癌细胞株MHCC97H增殖能力和黏附能力呈正相关,与细胞周期和细胞凋亡无相关性。第三部分Annexin A4基因RNAi后对人肝癌细胞株MHCC97H黏附相关分子表达的变化目的:探讨Annexin A4基因RNAi后对人肝癌细胞株MHCC97H黏附相关分子表达的影响。方法:将Annexin A4 siRNA转染人肝癌细胞株MHCC97H 48 h后,提取总RNA,逆转录成cDNA,Realtime-qPCR检测黏附相关分子integrinα5、integrinβ1、E-cadherin、ICAM1、CD44、OPN表达变化。结果:Realtime-qPCR结果显示,RNA干扰后黏附相关分子integrinα5、integrinβ1、E-cadherin表达分别较对原来减少3.23倍、1.53倍和1.26倍;而ICAM1、CD44、OPN变化不明显。结论:RNA干扰Annexin A4基因后黏附相关分子integrinα5表达明显减低,同时人肝癌细胞株MHCC97H黏附能力显著下降,提示Annexin A4基因可能通过调节integrinα5的表达进而影响细胞黏附。结论1.Annexin A4与肝癌细胞株转移潜能呈正相关。2.Annexin A4的表达与人肝癌细胞株MHCC97H增殖能力和黏附能力呈正相关,与细胞周期和细胞凋亡无相关性。3.RNA干扰Annexin A4基因后黏附相关分子integrinα5表达明显减低,同时肝癌细胞株MHCC97H黏附能力显著下降,提示Annexin A4基因可能通过调节integrinα5的表达进而影响细胞黏附。创新点1.采用RNAi技术特异性沉默Annexin A4基因,分析Annexin A4在肝癌细胞株中的功能。2.应用Realtime-qPCR技术分析Annexin A4基因RNA干扰后对黏附相关分子表达的影响。潜在应用价值1.Annexin A4是一个潜在的肝癌治疗和干预的靶点。2.为深入研究肝癌发生发展中Annexin A4在肝癌中的作用机制提供实验基础。