皮肤癣菌是能够引起皮肤癣菌病的数种真菌的总称,主要包括红色毛癣菌、犬小孢子菌、石膏样小孢子菌和须癣毛癣菌,可引起皮肤瘙痒、圆形丘疹和脱毛等症状,严重影响患病动物的生活质量。目前,化学合成抗真菌药(Chemosynthetic anti-fungal drugs,CAD)是防治皮肤癣菌病的首选药物,具有起效快、使用方便和价格低廉等优点。然而,单一和过量使用CAD导致皮肤癣菌病复发频繁;再者,CAD无法单独有效抑制皮肤癣菌感染所致皮肤局部炎症和过敏反应。近来,CAD(诸如氟康唑和酮康唑)联合植物精油活性成分可协同抗白色念珠菌、马拉色菌等真菌,可降低CAD用量,并且无复发;植物精油活性成分能够抑制细菌脂多糖刺激巨噬细胞和嗜碱性粒细胞的炎性细胞因子分泌和组织胺释放等免疫反应,已经见诸报道。因此,CAD联合植物精油活性成分有望应用于防治皮肤癣菌病。但现有药物剂型无法高效递送抗皮肤癣菌药物至毛囊等皮肤癣菌藏匿处,导致皮肤癣菌病复发。纳米乳凝胶为载药量高和稳定性好的皮肤给药系统,调整纳米乳凝胶中增稠剂含量可改变其透皮性能以递送抗皮肤癣菌药物至皮肤目标层,可达到杀灭皮肤癣菌和防止皮肤癣菌病复发的目的。本研究从8种植物精油活性成分和4类CAD中选取具有最强协同抗皮肤癣菌作用的植物精油活性成分和CAD组合,研究两者联合用药抗皮肤癣菌的作用方式和机理、阐述植物精油活性成分对皮肤癣菌侵染条件下皮肤关键免疫细胞的免疫调节作用,并且制备两者纳米乳凝胶以验证对皮肤癣菌病的治疗效果,为植物精油活性成分联合CAD防治皮肤癣菌病提供理论基础。主要结果如下:1.体外抑菌和扫描电镜观察等试验确定了最佳植物精油活性成分和CAD组合以及二者抗皮肤癣菌作用方式。结果表明,柠檬醛与特比萘芬为最佳组合,呈强烈的协同抗皮肤癣菌作用,可降低孢子萌发率,造成皮肤癣菌菌丝扭曲和干瘪,增大抑菌圈和增加杀菌曲线下移速率。2.透射电镜、流式细胞仪和GC-MS等试验阐明了柠檬醛与特比萘芬抗皮肤癣菌的机理。结果表明,柠檬醛与特比萘芬未干扰几丁质和1,3-β-D-葡聚糖的合成;两者抑菌作用未受原生质体保护剂山梨醇的影响,因此,两者作用位点不在细胞壁。柠檬醛与特比萘芬可造成皮肤癣菌细胞膜破损、胞质流出、线粒体变形、液泡增大扭曲和细胞器瓦解;两者显著增加皮肤癣菌细胞质流出率和细胞膜破损的孢子数(P<0.05),造成细胞膜中麦角固醇显著降低和脱氢麦角固醇含量显著升高(P<0.05),因此,两者作用位点位于麦角固醇合成途径。特比萘芬可使角鲨烯异常累积,而柠檬醛可使角鲨烯和麦角甾-8,22-二烯-3β-醇含量异常累积,两者联合可互为增强对角鲨烯的异常累积作用,从而导致麦角固醇含量下降,细胞膜破损后菌体死亡,同时降低特比萘芬用量。3.以人永生化角质形成细胞(Hacat)和小鼠巨噬细胞系(Raw264.7)为考察对象,开展细胞毒性、细胞因子检测、孢子吞噬和孢子粘附等试验,阐述了柠檬醛对皮肤癣菌侵染条件下皮肤关键免疫细胞的免疫调节作用。结果表明,柠檬醛可抑制皮肤癣菌孢子“粘附”至Hacat;减弱甘露聚糖蛋白抑制Hacat有丝分裂的作用,显著增加G2M和S期细胞数量(P<0.05);降低Raw264.7吞噬后的皮肤癣菌孢子存活率;显著降低Hacat受皮肤癣菌孢子刺激后分泌IL-8、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量(P<0.05);显著抑制Raw264.7受皮肤癣菌孢子刺激后分泌TNF-α、IL-10、IL-12和NO(P<0.05)。4.以增稠剂卡波姆-934的含量为考察对象,开展体外透皮试验和CLSM观察试验,确定了最佳增稠剂含量以使柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶适用于防治皮肤癣菌病。随卡波姆-934含量升高,柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶可显著降低药物透皮速率,提高柠檬醛和特比萘芬在角质层和表皮层沉积量(P<0.05);将药物递送主要路径由皮肤附属器变为细胞间隙;明显缩小表皮细胞间和胶原纤维间的缝隙。5.通过柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶治疗皮肤癣菌病和皮肤组织PAS染色观察试验,检验了CNG治疗皮肤癣菌病的效果。结果表明,柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶中、高剂量组的临床有效率(60.18%和65.96%)和真菌清除率(66.67%和75%)显著高于(P<0.05)或相当于(P>0.05)特比萘芬凝胶组(60%和58.33%);柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶中、高剂量组的皮肤角质层、表皮层、毛囊和毛干中皮肤癣菌菌丝和孢子量明显减少,毛囊状态明显改善。本研究证实:(1)特比萘芬联合柠檬醛互为增强对角鲨烯的异常累积而呈强协同抗皮肤癣菌作用,并且明显减少特比萘芬用量;(2)柠檬醛能够调节皮肤关键免疫细胞对皮肤癣菌的免疫应答;(3)增稠剂含量升高可降低纳米乳凝胶透皮效率,有助药物沉积于表皮浅层以适应防治皮肤癣菌病需要;(4)柠檬醛-特比萘芬纳米乳凝胶对皮肤癣菌病疗效确切。