类风湿关节炎(rheumatoidarthritis,RA)是一种慢性全身性自身免疫性疾病,以类风湿因子(rheumatoid factor,RF)、抗瓜氨酸蛋白抗体(anti-citrullinated protein antibody,ACPA)等自身抗体的产生为特征,典型的临床表现为侵蚀性关节炎,亦可伴有关节外器官损伤。未经正规治疗的RA患者可出现关节畸形和功能丧失,极大地影响患者的生活质量。近年来,随着生物制剂等药物的研发以及“个体化”、“达标治疗”等概念的提出和运用,RA患者的预后已得到极大改善。但是,临床诊疗过程中仍存在患者对药物的反应不佳及出现严重药物不良反应等情况,使得当前针对RA的诊疗仍面临巨大的挑战。RA的具体病因不清,目前认为其发病与遗传、环境和免疫等因素的相互作用密切相关。其发病主要分为以下几个阶段:首先是遗传变异在环境因素的作用下诱发机体出现免疫紊乱,随后出现局部炎症浸润及系统性免疫反应。局部炎症浸润可引起关节滑膜炎症及血管翳形成,最终导致软骨基质破坏和骨侵蚀。同时,系统性免疫反应可引起类风湿结节、血管炎和纤维化等病变,导致心、肺、肾等全身多器官损害。其中,免疫紊乱被认为是RA发病过程的中心环节,其与自身反应性T细胞和B细胞的异常增殖以及自身抗体的大量产生密切相关。滤泡调节性T细胞(T follicular regulatory cell,Tfr)是一种具有免疫抑制功能的新型调节性T细胞亚群(T regulatory cell,Treg),其可同时表达转录因子Foxp3和Bcl-6,以及CD25、ICOS、PD-1、CXCR5等表面分子,兼具调节性T细胞和滤泡辅助性T细胞(T follicular helper cell,Tfh)的表型特征,对Tfh细胞、B细胞以及抗体生成的调控具有十分关键的作用。已有研究表明,Tfr细胞数量及功能的异常可导致机体免疫稳态被打破,与自身免疫性疾病、过敏性疾病、移植排斥反应以及感染性疾病等多种疾病的发生发展密切相关。RA中关于Tfr细胞的研究较少,其表型和功能是否异常以及能否介导RA免疫紊乱的发生发展尚不明确。为阐明这一问题,本研究从RA中Tfr细胞的表型特征、Tfr细胞在RA免疫紊乱中的作用以及RA免疫炎症对Tfr细胞的影响和机制三个方面进行了的探究,研究的结果和结论为理解RA发病机制提供了新的视角,为寻求RA治疗靶点提供了理论依据,有助于提高RA的诊治水平。第一部分RA患者及CIA模型中滤泡调节性T细胞的表型特征目的:研究RA患者及胶原诱导的关节炎模型(collagen-inducedarthritis,CIA)中滤泡调节性T细胞的比例、临床相关性及标志性分子的表达水平等表型特征。方法:我们利用密度梯度离心法分离了 RA患者和健康对照(health controls,HC)的外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cells,PBMC),流式细胞术检测Tfr细胞的比例、其随病情的变化、标志性分子的表达水平以及功能性Treg细胞的比例,并将Tfr细胞比例与临床指标进行关联性分析。此外,我们还利用Ⅱ型胶原免疫DBA/1小鼠以建立CIA模型,分离小鼠脾脏淋巴细胞,流式细胞术检测CIA小鼠脾脏淋巴细胞中Tfr细胞的比例和标志性分子的表达水平。结果:相比HC,RA患者外周血Tfr细胞的比例显著降低,Tfh细胞的比例显著升高。RA中Tfr细胞的比例与DAS28评分及血浆CRP、ACPA、IgG水平呈负相关关系,且RA患者经治疗缓解后,Tfr细胞和Tfh细胞比例紊乱的情况可得到改善。相比HC,RA患者外周血Tfr细胞中Foxp3、ICOS及CCR7的表达水平显著降低,PD-1的表达水平显著升高,效应型Treg细胞比例显著减少。在CIA疾病高峰期取材发现,相比对照小鼠,CIA小鼠脾脏淋巴细胞中Tfr细胞的比例降低,Tfh细胞的比例升高,且Tfr细胞中Foxp3和ICOS的表达水平显著降低。结论:RA患者及CIA模型中Tfr细胞的表型相比健康对照存在异常,表明其增殖分化和功能可能受到抑制,进而可能介导RA免疫紊乱的发生发展。第二部分滤泡调节性T细胞在RA免疫紊乱中的作用目的:探究RA中滤泡调节性T细胞的功能状态及其在免疫紊乱中的作用。方法:为检测RA中Tfr细胞的增殖能力,我们利用CFSE标记Tfr细胞,并对其进行扩增刺激,流式细胞术检测CFSE的表达水平。随后,我们分选了 RA患者及HC的外周血Tfr细胞、Tfh细胞和B细胞,构建共培养体系,ELISA法检测共培养上清中IgG、IgM的含量,流式细胞术检测共培养体系中Tfh细胞的增殖能力以及B细胞亚群比例。结果:相比HC,RA患者外周血Tfr细胞的增殖能力显著降低。共培养体系中,相比HC Tfr细胞组,RA Tfr细胞组共培养上清中免疫球蛋白的含量、Tfh细胞的增殖水平及记忆性B细胞的比例升高。结论:RA患者外周血Tfr细胞的增殖能力和免疫抑制能力显著降低,可导致Tfh细胞和B细胞反应亢进,产生大量抗体,进而可介导RA免疫紊乱的发生发展。第三部分炎症对滤泡调节性T细胞的影响和机制目的:探究RA免疫炎症对滤泡调节性T细胞增殖和功能的影响及机制。方法:首先通过血浆交叉培养、血浆细胞因子检测、重组细胞因子体外刺激及临床关联性分析筛选出RA中可能调控Tfr细胞的细胞因子。随后利用筛选出的细胞因子对Tfr细胞进行体外刺激,直接检测其对Tfr细胞增殖及功能的影响。最后,通过检测通路蛋白及转录因子明确细胞因子对Tfr细胞的调控机制。结果:利用RA血浆培养的HC PBMC中Tfr细胞比例降低,Tfh细胞比例升高。而RA BMC经HC血浆培养后,Tfr细胞比例升高,Tfh细胞比例降低。相比HC,RA患者血浆中IL-2、IL-6、IL-17、IL-21及TNF-α的含量显著升高。细胞因子体外刺激实验的结果显示,IL-21可引起Tfr细胞比例降低,Tfh细胞比例升高。关联性分析结果表明,RA患者血浆中IL-21的表达水平与DAS28评分、IgM水平呈正相关关系,与外周血Tfr细胞比例以及Tfr/Tfh比值呈负相关关系。进一步探究发现,IL-21刺激可导致Tfr细胞的增殖能力及其对Tfh细胞增殖和抗体产生的抑制能力降低。利用通路蛋白检测,我们发现,IL-21可通过下调pAkt降低Tfr细胞中关键转录因子Foxp3的表达水平,进而可导致Tfr细胞的表型紊乱和功能抑制。相比HC,RA患者Tfr细胞中Foxp3的表达对于IL-21介导的pAkt下调机制更为敏感。结论:RA患者血浆中IL-21的含量显著升高。IL-21可通过下调pAkt降低Tfr细胞中关键转录因子Foxp3的表达水平,进而抑制Tfr细胞增殖,并削弱其免疫抑制功能,导致Tfh细胞过度增殖和抗体大量产生,最终介导RA免疫紊乱的发生发展。