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附红细胞体(Eperythrozoon)是一类附着于人和动物红细胞表面,或者游离于血浆中的不可培养的病原微生物。此类病原的感染会引起急性溶血性贫血从而对宿主致死,或者引起轻微的慢性贫血,宿主表现为生长发育不良,不孕和免疫抑制等,从而给畜牧业带来巨大的经济损失。虽然至今已经建立了一系列附红细胞体的诊断技术,但是不同的诊断方法各有其优缺点,因此需要建立更加敏感、高效、准确的附红细胞体检测方法。另外,关于附红细胞体与红细胞之间的具体粘附机制研究仍然是空白,因此对附红细胞体粘附相关蛋白进行筛选以及功能研究对于阐述此种病原的致病机制就显得尤为重要。鉴于以上原因,本研究首先建立了温氏附红细胞体的环介导等温扩增(LAMP)检测方法,利用该方法对国内部分地区的温氏附红细胞体的流行情况进行了调查,同时也对可能的传播媒介中温氏附红细胞体的存在情况进行了检测；随后建立了基于猪附红细胞体MSG1蛋白的间接ELISA方法,并进行了初步的临床应用；之后从猪附红细胞体的基因组信息中选择了五个可能的粘附相关蛋白,对这五个蛋白与猪红细胞膜之间的粘附能力进行了研究。(1)温氏附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)检测方法的建立及应用根据GenBank中温氏附红细胞体16S rRNA基因序列设计一对检测温氏附红细胞体的PCR引物F3、B3,建立PCR检测方法；同时设计一组特异性检测温氏附红细胞体的LAMP引物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB,建立LAMP检测方法。敏感性试验结果显示,LAMP方法比PCR方法的敏感度高出十倍。利用建立的两种方法同时对来自全国部分地区共330份牛血液样品进行了检测,LAMP方法检测出了71份阳性样品,而PCR方法仅检测出了62份阳性样品,且所有PCR方法检测阳性的样品均为LAMP检测阳性。通过测序对9份PCR检测阴性但LAMP检测阳性的样品进行了分析,结果证实此9份样品均为温氏附红细胞体感染。此外,利用两种检测方法同时对牛棚中采集的17只蜱、24只虱子、25只蚊子、22只蝇进行了温氏附红细胞体的检测,结果显示PCR和LAMP方法均在7只蜱、13只虱子、16只蚊子、以及22只蝇中检测到了温氏附红细胞体的存在。此结果提示此类节肢动物作为附红细胞体传播媒介的可能性。(2)基于温氏附红细胞体16S rRNA基因进化树的构建通过将部分温氏附红细胞体阳性样品的16S rRNA基因全长序列进行克隆测序,得到8条来自于河南(HN)、江苏(JS)、湖北(HB)、四川(SC)、安徽(A11)等地的温氏附红细胞体16S rRNA基因序列。将此八条序列与Genbank中所下载的其他血营养型支原体相关序列用MEGA软件采用邻接法建立进化树。通过进化树可以看出,所获得的八条序列均位于温氏附红细胞体的分支上,不同的地理分离株之间没有明显的差异,而相对于猪附红细胞体来说,温氏附红细胞体与羊附红细胞体的亲缘关系更为接近,所有的血营养型支原体构成了一个独立的分支,并且与肺炎支原体比较接近。(3)猪附红细胞体间接ELISA检测方法的建立及初步应用根据Genbank中猪附红细胞体(Mycoplasma suis) MSG1基因序列(GenBank ID: AM407404.1)为靶基因设计了一对可以扩增猪附红细胞体MSG1基因主要抗原决定部位的PCR引物,经过克隆测序后,将此段基因插入原核表达载体pET28a,之后进行MSG1蛋白的原核表达。通过对IPTG诱导时间以及诱导浓度进行优化,最终确定MSG1重组蛋白原核表达的最佳条件,在此条件下进行MSG1蛋白的大量提取。利用提取的MSG1重组蛋白建立了检测猪附红细胞体的间接ELISA方法,且此方法具有良好的特异性及重复性。将建立的间接ELISA方法进行了初步的临床应用,初步检测结果显示成年猪中猪附红细胞体感染的抗体阳性率明显高于小猪。(4)猪附红细胞体粘附蛋白的筛选从Genbank中公布的猪附红细胞体基因组文库中选择了五个假定粘附蛋白,分别用粘附ELISA试验以及血涂片粘附试验对这五个蛋白的粘附效果进行了比较。为了让这五个蛋白能够在大肠杆菌表达系统中顺利表达,先进行了碱基点突变试验优化其密码子；之后利用表达的重组蛋白制备多克隆抗体血清,随后进行了多抗血清IgG的纯化以及生物素标记；粘附ELISA结果显示,GAPDH蛋白具有最强的粘附于猪红细胞膜的能力,其次为OSGEP蛋白；粘附抑制试验说明此两种蛋白的多抗血清能够特异性的阻断其粘附作用；五个蛋白的大肠杆菌亚细胞定位结果显示,此五个重组蛋白分别在大肠杆菌的菌膜和菌质中均有表达；血涂片粘附试验结果与粘附ELISA结果吻合,表达GAPDH蛋白以及OSGEP蛋白的大肠杆菌转化株获得了粘附于猪红细胞的能力。本研究建立的温氏附红细胞体环介导等温扩增(LAMP)方法以及猪附红细胞体间接ELISA检测方法为进行温氏附红细胞体以及猪附红细胞体的流行病学调查以及其潜在的致病风险因子的评估提供了手段；猪附红细胞体粘附蛋白的筛选为深入研究其粘附以及致病机制奠定了基础。