【目的】本研究以甘肃某三甲医院各临床科室各类标本中分离的病原菌为研究对象,对此类细菌进行分布调查及耐药表型监测;对引起医院感染最常见的多重耐药的金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌耐药机制进行分子水平研究。从而全面系统了解甘肃省某三甲医院临床各类标本中引起医院感染的细菌种类别及临床分布、耐药特点和耐药机制。进一步了解引起医院感染排列前10位的大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌、屎肠球菌、洛菲不动杆菌等病原菌对临床常用的15种抗菌药物的耐药表型及各种引起临床感染的各类病原菌对抗菌药物的耐药特点。为甘肃地区临床医生经验型选用抗菌药物用于诊治医院感染性疾病以及为当地卫生管理部门制定遏制耐药菌传播的对策提供科学依据。【方法】严格按照临床微生物标本采集规范从甘肃省某三甲医院呼吸科、血液科、泌尿外科、肿瘤科、重症监护病房(ICU)、神内科、肾外科、妇产科、耳鼻喉科、鼾病科、小儿科等临床各科室采集血液、痰液、肺泡灌洗液、尿液、胆汁、粪便、伤口分泌物、咽拭子、脑脊液等标本。根据标本类型,选择自动化血培养仪配套的需氧及厌氧菌专用血液培养瓶进行血培养;选用绵羊血琼脂基础平板、巧克力琼脂·平板、麦康凯琼脂平板当作其他临床标本中分离细菌用分离培养基。根据全国《临床检验操作规程》第三版进行准确操作。利用分段划线技术将不同类型标本接种于该规程规定的相应的琼脂平板上,置35℃普通环境或35℃,CO2环境孵育18-24h,挑取可疑菌落,进行直接涂片及革兰染色,然后在显微镜下观察细菌形态,根据细菌的革兰染色特点及形态特点,确定待检菌是革兰阴性或阳性,球菌或杆菌。结合细菌显微镜下形态特点,采用传统手工方法、自动化仪器(法国Vitek32微生物自动化分析仪、美国MicroScan-Auto-4半自动细菌分析仪)、API系统细菌鉴定系统(法国生物梅里埃公司)进行菌株准确鉴定;采用WHO推荐的琼脂扩散法(K irby-Bauer method,K-B法)进行药敏试验。革兰阳性菌和革兰阴性菌选择不同的药物进行药敏试验,临床常用药物包括青霉素、氨苄西林、苯唑西林、庆大霉素、丁胺卡那、左氧氟沙星、环丙沙星、头孢唑啉、头孢呋新、头孢噻肟、头孢他啶、亚胺培南、多粘菌素、红霉素、四环素等。采用双纸片协同法检测大肠埃希菌、克雷伯菌、奇异变形杆菌的ESBL S检测;采用头孢西丁法筛选耐甲氧西林葡萄球菌菌株;采用E-test法检测青霉素耐药肺炎链球菌分离菌株;用K-B法检测万古霉素耐药的肠球菌属细菌菌株。根据最新版的美国临床微生物研究协会(Clinical and Laboratory Standards Institute,CLSI)指南判断细菌耐药性结果。采用统一的细菌耐药监测方案对待检菌的耐药性进行动态监测,用WHONET5.6软件统计分析数据。采用PCR技术进行金黄色葡萄球菌mecA基因、SCCmec分型、fem基因、耐消毒剂基因检测;采用脉冲场凝胶电泳技术(PFGE)对金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌进行同源性检测;采用PCR技术对鲍曼不动杆菌进行整合子检测。【结果】本论文研究结果如下:(一)菌群分布2008年1月-2012年12月从各病区临床标本中共分离出病原菌10430株,其中革兰阳性菌2900株,占27.8%;革兰阴性菌7530株,占72.2%。监测结果表明,甘肃省某三甲医院引起医院感染前10位的细菌为:大肠埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(K lebsiella pneumoniae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、阴沟肠杆菌(Ente robacter cloacae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomon as aeruginosa)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus f aecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、洛菲不动杆菌(Acinetobacter lwoffi)。某三甲医院位居前十位的革兰阳性菌分别为:金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aure us)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、肺炎链球菌(Str eptococcus pneumoniae)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)、草绿色链球菌(Streptococcus spp.)、棉子糖肠球菌(Enterococcus raffinosus)、溶血葡萄球菌(Staphylococcus hae molyticus)。某三甲医院位居前十位的革兰阴性菌分别为:大肠埃希菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)、鲍曼不动杆菌(Ac inetobacter baumanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、洛菲不动杆菌(Acinet obacter lwoffi)、副流感嗜血杆菌(Parahaemophilus influenzae、嗜麦芽窄食单胞菌(Sten otrophomonas maltophilia)、流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)、弗劳地枸橼酸杆菌(Citrobacter freundii)。5年来该三甲医院病原菌株不同病房分布情况分别为:呼吸科病房前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌。血液科病房前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌。泌尿外科病房前5位细菌:大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌、阴沟肠球菌、奇异变形杆菌。肿瘤科病房前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠球菌。重症监护病房(ICU)前5位细菌:鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。神经内科病房前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌。神经外科病房前5位细菌:鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。妇产科病房前5位细菌:大肠埃希菌、表皮葡萄球菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、肺炎克雷伯菌。鼾病科病房前5位细菌:肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌。小儿科病房前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、肺炎链球菌、表皮葡萄球菌、阴沟肠杆菌。5年来该医院不同的临床标本中细菌分布分别为:血液标本中分离的前5位细菌:下呼吸道标本前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌。尿液标本前5位细菌:大肠埃希菌、粪肠球菌、屎肠球菌、阴沟肠球菌、奇异变形杆菌。胆汁标本前5位细菌:大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、粪肠球菌、屎肠球菌。伤口分泌物标本前5位细菌:金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、阴沟肠杆菌、表皮葡萄球菌、粪肠球菌。(二)5年监测研究的各类细菌耐药谱革兰阳性菌中,金黄色葡萄球菌为引起医院感染的重要细菌之一。其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)和凝固酶阴性葡萄球菌(MRCONS)、耐万古霉素的肠球菌(VRE)、耐青霉素的肺炎链球菌(PRSP)是革兰阳性菌中的重点监测对象。金黄色葡萄球菌(Sta phycocci aureus)和凝固酶阴性葡萄球菌中甲氧西林耐药株(MRSA和MRCNS)平均为55.0%和70.7%。葡萄球菌属中耐甲氧西林菌株对β-内酰胺类抗菌药物和其他类的抗菌药物的耐药率显著高于甲氧西林敏感株,5年的耐药监测研究中,未发现万古霉素、替考拉宁和利奈唑胺耐药株。肠球菌中,屎肠球菌的耐药率明显高于粪肠球菌,非脑膜炎来源的肺炎链球菌分离率有所增高,未发现耐青霉素类药物的肺炎链球菌(PRSP)。革兰阴性菌中,产超广谱β-内酰胺酶(ESBL_S)的大肠埃希菌、克雷伯菌属细菌和奇异变形杆菌以及多重耐药的鲍曼不动杆菌是本监测研究的重点菌种。大肠埃希菌产ESBL_S百分率:2008年为65.7%,2009年为64.8%,2010年为73.3%,2011年为71.2%,2012年为70.3%;克雷伯菌属细菌(肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌)产ESBL_S率:2008年38.8%,2009年30.5%,2010年为30.8%,2011年为31.2%%,2012年为30.8%。奇异变形杆菌产ESBLS率2008年38.8%;2009年30.5%;2010年为30.8%;2011年为20.1%;2012年为21.2%。肠杆菌科细菌中产ESBL_S菌株对抗菌药物的耐药率均高于不产E SBL_S细菌的耐药率。肠杆菌科细菌对碳氢酶烯类药物仍然保持较高的敏感性,总耐药率小于2%。5年来,铜绿假单胞菌对亚胺培南、美罗培南的平均耐药率分别为9.2%、8.9%;鲍曼不动杆菌对以上药物的平均耐药率分别为29.1%和28.2%。(三)多重耐药MRSA的mec A、SCCmec分型、杀白细胞毒素(PVL)、耐消毒剂基因(QacA/B)检测收集烧伤创面、下呼吸道标本,进行病原菌分离,分离出耐甲氧西林金黄色葡萄球菌102株,采用PCR技术对其进行mecA检测、SCCmec基因分型、杀白细胞毒素(PVL)检测及耐消毒剂基因(Qac A/B)检测。结果表明:某三甲医院烧伤创面标本及呼吸道标本中分离的MRSA中均检出mecA基因;SCCmec分型多数为SCCmecⅢ型,少数为SCCme cII型,未分离出SCCmecVI型;所有菌株中均未检测出PVL,MRSA中耐消毒剂基因(q acA)检出率较高,占38.7%。(四)多重耐药鲍曼不动杆菌耐药性分子水平研究收集临床标本中分离的鲍曼不动杆菌,用K-B纸片扩散法对其进行细菌药敏试验;采用PFGE技术进行同源性检测。【结论】1.5年来的监测研究结果表明,在甘肃某三甲医院,引起的医院感染的病原菌在不同病区病原菌谱不同;不同的临床标本中病原菌分布也有差异。2.从5年来的监测结果看出,在甘肃某三甲医院某些细菌耐药性变化趋势不大,但有些细菌耐药性呈增长趋势。耐甲氧西林葡萄球菌(MRSA)、产ESBLS大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌具有较高的分离率但MRSA有下降趋势。多重耐药的MRSA、多重耐药和泛耐药的革兰阴性杆菌已经成为感染性疾病防治面临的严峻挑战,应引起医院各科室临床医生以及医院管理部门的高度重视。临床医生可根据医院细菌室提供的菌种报告和耐药性报告合理选择抗菌药物治疗患者;在细菌培养结果出来前临床医生可根据耐药监测数据经验型选择抗菌药物治疗患者。3.在甘肃某三甲医院,由多重耐药菌尤其MRSA引起的医院感染已很普遍,而且广泛耐医院常用的季铵盐类消毒剂,已经成为医生抗感染治疗的棘手难题,应引起相关部门足够重视。4.从分子水平对MRSA耐药机制进行研究,MRSA主要耐药机制是mecA介导的PB P2a蛋白的产生;SCCmec是染色体基因岛,有区域性差异。某三甲医院分离的所有MRS A均含有mecA基因,SCCmec型别以SCCmecIII型为主,其次为SCCmecII型,其他型少见。所分离的MRSA中耐消毒剂基因检出率为100%,预示MRSA对医院常用的消毒剂耐药。5.从分子水平对鲍曼不动杆菌进行同源性研究,鲍曼不动杆菌有较高的同源性,为克隆株流行。6.在医院感染防治中,针对革兰阳性菌和革兰阴性菌中多重耐药的重点细菌金黄色葡萄球菌和鲍曼不动杆菌,除检测其耐药表型外,还应采用分子生物学方法检测其耐药机制,该研究可为进一步采取有效措施控制耐药菌在医院内播散和暴发流行提供参考依据。7.5年的细菌耐药监测研究表明,开展细菌耐药监测对遏制多重耐药菌的播散意义重大。