背景:骨质疏松症是一类伴随年龄衰老或医学原因一起的,以骨量丢失、骨密度降低、骨组织显微结构破坏、骨脆性增加、骨强度下降,以及易于发生骨折为主要临床特征的代谢性、全身性骨骼疾病。WHO于1994年制定了以骨密度测量为基础,诊断骨质疏松的标准为骨密度值低于或等于正常年轻人2.5个标准差即可诊断为骨质疏松,有过一次或多次骨折经历的都肯定有严重的骨质疏松。随着全球人口的老龄化,骨质疏松在全世界常见病、多发病中的地位逐渐上升至第七位。在我国骨质疏松症也已跃居常见病第六位,患病人数已达到9500万。其中50～60岁的发生率为21%,60～70岁的为58%,70岁以上几乎是100%,尤以绝经后妇女的发生率更高,据调查显示,50岁以上男性及40岁以上女性都有不同程度的骨质疏松,随着年龄的增加,骨质疏松的发生率明显增加。健康人的骨密度(矿物质含量)在30岁以前是上升的,并在30～39岁达到高峰,到40岁以后逐渐下降,矿物质量下降往往没有感觉或者感觉轻微,只有在减少12%以上时才会出现变矮、驼背、弯腰等临床症状,并且随着年龄的增加和矿物质含量的减少而加重。当患者发生骨折时,此时的矿物质含量丢失已达25%以上。目前治疗骨质疏松的主要方法分为饮食治疗和药物治疗,通过调整饮食结构、补充钙剂及维生素D等具有一定的治疗效果。药物治疗主要分为抑制骨吸收药物和促进骨形成药物,前者包括雌激素替代疗法、降钙素、维生素D及其代谢产物、二膦酸盐、异黄酮衍生物等,后者有甲状旁腺激素、氟化物、他汀类药物、钙剂、锶盐、男性激素治疗等。在增加骨量促骨形成的代谢药物中,目前只有甲状旁腺激素(商用名:特里帕肽)获得认可。甲状旁腺激素对骨代谢具有独特的作用,这是其它药物所不具备的。这些作用主要包括增加骨密度、促进骨微结构的重塑以及降低骨折的发生率。甲状旁腺激素(PTH)是调节骨代谢的重要激素之一。美国FDA于2002年批准使用低剂量甲状旁腺激素间断注射用于治疗骨质疏松,在2010年,我国批准使用PTH用于治疗绝经后老年女性、老年男性及由糖皮质激素引起的骨质疏松症。其治疗效应可能是通过抑制细胞凋亡从而增加成骨细胞数量最终增加骨量来实现的。虽然间断性小剂量应用可促进骨形成,但是连续大剂量应用会促进骨吸收以及可能存在致癌的风险和减低PTH的疗效,因此优化PTH,促进疗效,缩短使用时间,避免其副作用是目前PTH领域研究的重要方向之一。PTH引起的这两种极端的效应,是由于PTH的作用效果是与时间和剂量相关的。体内和体外研究表明,PTH具有刺激成骨细胞的增殖、分化和凋亡的能力。PTH及其相关肽(PTHrP)调节成骨细胞的增殖、分化和凋亡是通过激活甲状旁腺受体1(PTHR1)及其下游的多个信号途径实现的。目前研究表明,PTH的生物学效应主要通过以下三条信号通路的激活:分别是cAMP/PKA、PLC/PKC和nonPLC/PKC通路。PTH主要通过cAMP/PKA这条通路对骨的代谢进行调节,但这种调节是双向的并且与应用剂量相关。PLC/PKC信号通路对PTH的破骨作用起辅助增强的效应,而nonPLC/PKC信号通路具有能够特异性的对某些部位进行成骨调节的作用。参与介导PTH/nonPLC/PKC的亚信号通路还没有明确的界定,但是与其相关的研究提示存在多因子的参与及多亚信号通路的介导的可能。1)PTH(1-34)的 C 端结构,包括 PTH(3-34)和 PTH(29-34),介导nonPLC/PKC信号通路,具体的信号介导机制需要深入研究。2)不能排除cAMP/PKA参与介导nonPLC/PKC的可能。最近我们的研究发现cAMP/PKA选择性PTH模拟肽,G1y1Arg19hPTH(1-28),可激活PKC,提示cAMP/PKA可能部分参与 PTH/nonPLC/PKC 信号途径。3)Rho A/Rho Kinase/PLD 可能介导nonPLC/PKC。通过对这三条通路的研究以及在甲状旁腺激素基本结构的基础上,研究具有更强的成骨作用、结构更短、副作用更小的模拟肽是研究的重要方向之一。改变任何蛋白的氨基酸序列或者构象都会改变该蛋白的能力,PTH(1-34)也不例外,其构象的改变及氨基酸序列的变化都有可能影响某些信号通路的激活能力。如:PTH(1-34)完整的N端结构是cAMP/PKA和PLC/PKC通路的激活的必要条件;G1y1替换Ser1可使PTH(1-34)失去激活PLC的特性;Arg19替换Glu19能够补偿因29-34氨基酸残基缺失而引起的受体结合力减弱;当Leu 24,Leu28,val31突变成Glu后,PTH(5-34)不与受体结合;在PTH(1-14)的氨基酸残基中,Val2,G1u4,Ile5,Lys7,Met8,His9突变成Ala后,不能激活cAMP/PKA信号通路;在PTH(1-34)中,Ile5,Glu19,Va121等位点的突变,严重干扰PTH(1-34)与受体的结合力;Aib1,3,Nle8,21,Gln10,Har11,Ala12,Trp14,Arg19 构成的组合突变亦称M突变,M突变可使PTH(1-14)cAMP的合成能力提高约40倍,PLC的激活能力提高66倍,与PTHR的结合力提高约10倍;[Nle8,18,Tyr34]PTH(3-34)可使PTH(3-34)拥有激活cAMP/PKA通路的能力,但仍远小于(10倍以上)PTH(1-34)激活cAMP的能力等;基于以上PTH模拟肽的结构特点,通过利用PKC激活的荧光能量共振转移(FRET)技术,即通过加入不同的信号通路阻滞剂以及不同信号通路的模拟肽改变信号通路来观察FRET效率以及青色荧光与黄色荧光强度的比值(C/Y)是否改变以及改变的强度,以此来判断是否激活PKC。本课题组于近年设计和筛选出具有nonPLC/PKC通路特异性PTH模拟肽(简称MY1肽)。该MY1肽具有PTH/nonPLC/PKC的激活能力,即1)MY1肽激活PKC是与PTHR结合后通过PTH/nonPLC/PKC通路实现的并且不依赖于cAMP和PLC信号通路的激活。2)PTH/nonPLC/PKC模拟肽MT1肽具有显著增强成骨相关基因CITED1及ALP的作用。我们前期的研究揭示:PTH经nonPLC/PKC通路促进受力区松质骨合成,促进新骨形成,但是nonPLC/PKC通路的具体信号中介分子仍不清楚,相应的影响骨代谢的机理还需要深入研究。最近研究发现,PTH短时间(1小时)刺激引起的细胞增值主要是由PKA通路主导的,而PKC通路主要参与PTH的长时间(24和48小时)的刺激从而导致细胞增殖的减少和凋亡的增加。但是对于PTH/nonPLC/PKC信号通路对于细胞的增殖与凋亡目前尚不清楚。既往本课题组通过注射PTH(1-34)与G1R19(1-34)对去势小鼠骨折愈合的影响发现:发现PTH(1-34)和 G1R19(1-34)组骨密度明显高于 G1R19(1-28)组且 G1R19(1-34)组的骨小梁重建速度比G1R19(1-28)组更快,也就是PTH/nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁结构和增加受力区松质骨骨量的效应。基于PTH的基本结构,我们设计和筛选了不依赖PKA及PLC信号转导的特异性PTH/nonPLC/PKC信号通路选择性模拟肽MY1肽,利用MY1肽干预去睾丸小鼠股骨骨折的进程以及对比其与PTH(1-34)对股骨骨折的愈合以及对骨质疏松骨代谢的差异,观察该信号通路特异性模拟肽MY1肽对于骨折愈合和骨质疏松骨代谢的影响,通过分析胫骨骨松质及骨皮质和股骨骨折端骨痂区的差异,进一步明确PTH/nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。目的:1.观察甲状旁腺激素的非依赖PLC的PKC转导通路(PTH/nonPLC/PKC)是否会对成骨细胞(MC3T3E1)的凋亡以及细胞数量的影响。2.在显微CT上分析特异性PTH/nonPLC/PKC模拟肽对去势骨折小鼠的胫骨骨小梁、骨皮质的影响及股骨骨折的愈合情况,进一步了解nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。方法:培养MC3T3-E1细胞,以1.5×104密度接种到96孔板,然后置于培养箱培养3天直到细胞达到汇合状态,随机分为5组:1OOnmol/LG1R19hPTH(1-28)组;1OOnmol/IG1R19hPTH(1-34)组;1OOnmol/LG1R19hPTH(1-34)+1μmol/L Go6983组,1μmol/LGo6983组;空白对照组加入等体积的0.1%TFA(TFA为甲状旁腺激素模拟肽的溶剂),分别刺激细胞1小时,24小时,48小时,然后使用细胞计数试剂盒(CCK-8)和Caspase-Glo(?)3/7试剂盒(Caspase-3)检测细胞的数量及凋亡情况。选50只六周龄C57BL/6J雄性小鼠,饲养一周后,在异氟烷气体(300ml/min)吸入诱导麻醉后,于阴囊皮肤正中线切开越1cm,暴露双侧睾丸、附睾及周围组织,切除睾丸并缝合阴囊,术毕皮肤消毒。在去势后的1周后,异氟烷气体麻醉后,选择右侧大腿外侧作切口,在膝关节处逆行插入直径约0.45mm钢针进行髓内固定,然后钝性分离肌肉及软组织,在直视下用手术刀环形切断股骨中段,缝合切口,术毕皮肤消毒,造成股骨骨折模型。将50只小鼠随机分为5组。骨折术后第二天开始分别给予PTH(1-34)、0.1%TFA(空白对照组)、PTH(3-34)、MY1及MY2肽。骨折2周及4周后,使用显微CT分别测量小鼠非术侧胫骨骨皮质及骨小梁骨量和术侧股骨骨折处骨痂区愈合情况,根据显微CT参数分析nonPLC/PKC特异性模拟肽与PTH(1-34)对骨代谢影响的区别,从而判断nonPLC/PKC通路对骨代谢的影响。结果:通过分析细胞计数试剂盒(CCK-8),结果显示G1R19(1-34)组与G1R19(1-34)+Go6983组相比,在1小时及24小时具有提高细胞数量的趋势,但结果没有统计学差异,48小时G1R19(1-34)组与G1R19(1-28)组相比,可以明显提高细胞的数量(P<0.05)。进一步的研究发现在G1R19(1-34)组添加抑制剂Go6983后,细胞数量增多的效应消失(P<0.05)。Caspase-Glo(?)3/7试剂盒结果显示,G1R19(1-34)组与G1R19(1-34)+Go6983组相比,在1小时及24小时具有抑制细胞凋亡,但是差异无统计学意义。48小时检测凋亡显示,G1R19(1-34)组与G1R19(1-28)组相比,前者可以明显抑制细胞的凋亡(P<0.05),给予PKC抑制剂Go6983后,这种抑制凋亡的现象消失。通过切除小鼠睾丸,制造骨质疏松模型,1周后再次进行手术横切股骨中段,造成骨质疏松股骨骨折模型。药物刺激2周及4周后,处死小鼠,血清学检测分析显示,MY1肽组与空白对照组相比,钙离子及ALP明显升高并且具有统计学差异(P<0.05)。显微CT分析得,在2周及4周时,MY1肽组与空白对照组相比,其具有改善骨小梁结构并且提高骨小梁的骨密度及骨量,同时也会提高胫骨骨皮质周径并且能够促进骨折的愈合。结论:1.初步发现PTH的nonPLC/PKC信号转导通路可能在长时间(48小时)作用于MC3T3-E1细胞时,会抑制成骨细胞凋亡,增加成骨细胞数量。这有益于我们加深对PTH/nonPLC/PKC通路的理解,并为甲状旁腺激素对骨质疏松的治疗增添了新的研究方向。2.nonPLC/PKC通路具有改善骨小梁结构且促进受力区松质骨的合成.;3.PTH(1-34)促进骨细胞的分化,增加骨量改善骨小梁退化的效应,最主要是由PTH/nonPLC/PKC转导通路引起的。4.nonPLC/PKC通路特异性模拟肽在短时间刺激时(2周),可提高皮质骨的骨量及骨密度。5.nonPLC/PKC通路特异性模拟肽能够促进骨折的愈合并且在短时间刺激下(2周)可提高骨痂区骨骨密度的效应。