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鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是耳鼻咽喉头颈外科最常见的恶性肿瘤,常因病灶复发和头颈部淋巴结转移而影响患者生存质量。目前放疗为鼻咽癌治疗的首选,但是由于鼻咽癌早期症状并不典型,患者往往错过治疗的最佳阶段,彻底清除鼻咽癌细胞存在较大困难。以T细胞过继治疗为基础发展而来的嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,CAR)T细胞治疗技术因其特有的靶向性,特异性杀伤肿瘤细胞成为肿瘤免疫治疗的“新贵”。目前,以CD19为标靶的代表性CAR-T细胞治疗血液系统恶性肿瘤(特别是B细胞前体急性淋巴细胞白血病)取得明显的疗效,并被美国FDA批准上市。虽有CD19 CAR-T细胞顺利治愈复发性脑胶质瘤的个案,然而大部分实体瘤缺少特异性靶标和体内免疫逃逸机制,始终是CAR-T细胞应用于实体瘤必须攻克的两大难点。研究表明,鼻咽癌可由EB病毒感染所致。EB病毒介导鼻咽上皮细胞非极化,通过对EMT通路的调控诱导鼻咽部上皮细胞的转化,干扰正常鼻粘膜细胞的生理功能,促进鼻咽癌细胞的增殖、迁移、侵袭,并且抑制其凋亡。EB病毒潜伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)在鼻咽癌细胞的广泛表达,而在正常组织中基本不表达,使其成为最佳的诊断和治疗的靶点。本研究在利用抗体库技术制备全人源LMP1抗体的基础上,通过构建第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,制备第三代LMP1 CAR-T细胞,证实其在体内外对鼻咽癌细胞的增殖抑制作用,为鼻咽癌免疫治疗临床研究提供坚实的基础。研究目的1.制备针对LMP1基因的第三代CAR-T细胞2.优化LMP1 CAR-T细胞的增殖、分化与表达效率3.探讨LMP1 CAR-T细胞在体内外对鼻咽癌细胞的杀伤作用研究方法1.以实验室早期制备保存的高亲和力的全人源LMP1 Fab为模板,设计引物合成LMP1 sc Fv的重轻链,利用overlap PCR构建LMP1的sc Fv段,利用基因工程技术将LMP1 sc Fv段与含有CD8α,CD28,CD137,CD3ζ的慢病毒载体重组,制备第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,PCR法与测序用于验证所构建的LMP1 CAR慢病毒表达载体的正确性。2.LMP1 CAR慢病毒表达载体由转染试剂PEI转染到X-293T细胞,以CD3ζ抗体为一抗,Western blot法检测LMP1 CAR在X-293T细胞中的表达。3.应用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离健康志愿者外周血,提取PBMC,经CD3、CD28抗体激活,IL-2刺激扩增,获得足够量的T细胞。LMP1 CAR病毒包装产物感染T细胞制备LMP1 CAR-T细胞。4.培养鼻咽癌细胞(CNE1、CNE2、HONE1、C666-1与SUNE1),流式细胞术与Western blot法检测鼻咽癌细胞表面LMP1的表达,分别筛选LMP1高表达,低表达以及不表达的鼻咽癌细胞株。5.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1 CAR-T细胞,共培养6h后,CCK8法检测效靶比20:1、10:1、5:1、2:1时,LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞(CNE1、CNE2、HONE1)的杀伤作用。T细胞与CD19 CAR-T细胞设立为对照。6.CCK8法检测LMP1 CAR-T细胞在效靶比10:1时对鼻咽癌细胞的杀伤作用。LMP1高表达淋巴瘤细胞株Raji设立为对照。7.收集鼻咽癌细胞与制备的LMP1 CAR-T细胞,共培养24h后,收集上清,ELISA法检测LMP1 CAR-T细胞在鼻咽癌细胞刺激下,细胞因子(IL-2、IFN-γ)的分泌情况。T细胞与CD19 CAR-T细胞设立为对照。8.筛选Luciferase标记的LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1的稳定株。裸鼠单侧腋下注射CNE1细胞成瘤后,第0,3,6天瘤周注射CAR-T细胞,每次注射前进行活体成像,检测LMP1 CAR-T细胞在体内对LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的增殖抑制作用。CD19 CAR-T细胞,T细胞与生理盐水作为对照。9.裸鼠双侧腋下注射鼻咽癌细胞,一侧为100%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1,另一侧为50%LMP1阳性鼻咽癌细胞CNE1+50%LMP1阴性鼻咽癌细胞HONE1,成瘤后0,3,6天瘤周注射CAR-T细胞,分别于第0天与第9天进行活体成像,比较检测LMP1 CAR-T细胞对LMP1阳性与LMP1阴性鼻咽癌移植瘤的杀伤效应。研究结果1.成功制备第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,PCR结果显示条带大小与理论值一致,基因测序结果显示制备的LMP1 CAR序列正确。2.Western blot检测CD3ζ的表达,条带大小与理论值一致,结果显示LMP1CAR慢病毒表达载体能在X-293T细胞中表达。3.成功筛选出LMP1高表达鼻咽癌细胞株CNE1,LMP1低表达鼻咽癌细胞株CNE2与LMP1不表达鼻咽癌细胞株HONE1。4.CCK8结果显示LMP1 CAR-T细胞在效靶比20:1与10:1时对LMP1阳性的鼻咽癌细胞的杀伤作用与CD19 CAR-T细胞与T细胞相比具有统计学差异(P<0.05)。效靶比为10:1时,LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞CNE1、CNE2的杀伤率分别为(66.51±4.06)%和(49.91±6.81)%,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异(P<0.05)。而LMP1 CAR-T细胞对鼻咽癌细胞HONE1的杀伤率为(33.33±0.91)%,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异(P>0.05)。5.ELISA结果表明,LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为(1,962.58±54.65)pg/ml和(2,229.73±45.69)pg/ml;LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞CNE2共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为(550.86±98.64)pg/ml和(438.21±44.52)pg/ml,与CD19CAR-T细胞和T细胞相比具有统计学差异(P<0.05)。而LMP1 CAR-T细胞与鼻咽癌细胞HONE1共培养上清中IL-2、IFN-γ的分泌量分别为(95.31±30.60)pg/ml和(201.50±20.47)pg/ml,与CD19 CAR-T细胞和T细胞相比无统计学差异(P>0.05)。LMP1阳性细胞能刺激LMP1 CAR-T细胞释放IL-2与IFN-γ。6.单侧活体成像结果显示LMP1 CAR-T细胞在体内能抑制LMP1阳性鼻咽癌细胞移植瘤的增殖,与对照组具有统计学差异(P<0.05)。7.双侧活体成像结果显示LMP1 CAR-T细胞显著特异性抑制LMP1阳性鼻咽癌移植瘤的生长,而对LMP1阴性移植瘤无明显作用,与对照组具有统计学差异(P<0.05)。结论本研究成功构建第三代LMP1 CAR慢病毒表达载体,制备第三代LMP1CAR-T细胞,并证实LMP1 CAR-T细胞在体内外对LMP1阳性的鼻咽癌细胞具有增殖抑制作用。