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背景与目的:当前肿瘤研究的体外模型大多以传统二维(2D)培养模式为基础,而2D肿瘤模式因缺乏细胞外基质(ECM)、时空结构、养份浓度梯度等而与真正的肿瘤微环境差距甚远。越来越多的研究已经证实,3D肿瘤模型较2D模式在肿瘤微环境构建、基因表达差异、药物治疗耐受和放射治疗耐受研究中的优势愈发突显。本团队前期已经完成3D胶质瘤模型生物制造,构建了胶质瘤干细胞微环境,并证实3D胶质瘤模型比2D模式更加耐受药物治疗。然而,3D胶质瘤模型与2D模式的基因表达谱差异及对放射治疗的敏感性仍未明确。本研究拟1)使用明胶/海藻酸钠/纤维蛋白原的水凝胶体系体外生物制造3D培养脑胶质瘤模型;2)对比3D与2D脑胶质瘤培养模式的基因表达谱差异;3)筛选可能的放射敏感性相关基因,;4)通过体外放射治疗试验,验证3D与2D培养脑胶质瘤细胞的放射敏感性差异;5)探索3D培养胶质瘤模型放射抵抗的分子机制。方法:(1)利用海藻酸钠与氯化钙、凝血酶与纤维蛋白原化学交联的特性,以明胶为主要基质建立适宜细胞生长的水凝胶体系;(2)将生长状态良好的胶质瘤细胞与上述水凝胶体系进行充分混匀作为生物墨水,使用挤出式生物3D打印原理,将无菌注射器连接3D打印针头进行3D网状结构的生物制造;获得3D培养模型后,在细胞培养箱中继续培养:(3)体外生物学评价3D培养胶质瘤细胞模型的生长状态:包括显微镜下形态观察、活/死细胞染色、共聚焦和电镜下形态,以及HE病理切片染色等;(4)收集3D和2D培养胶质瘤模型的细胞,进行RNA测序,KEGG数据库分析,筛选差异基因及放疗耐受相关基因;(5)通过qRT-PCR和Western Blot验证该基因在3D和2D胶质瘤模型的表达差异;(6)用不同剂量X线(0、2、4、6、8Gy)照射3D和2D培养的胶质瘤模型,通过平板克隆实验比较克隆增殖能力,证实3D和2D胶质瘤模型放疗敏感性差异;(7)通过qRT-PCR和Western Blot定量差异基因表达水平,确定该基因与3D培养胶质瘤模型放疗耐受的关系;(8)shRNA干扰上述基因后行放射治疗,验证该基因在3D培养胶质瘤模型耐放疗的作用,并进一步探索相关信号通路。结果:(1)电镜下观察3D水凝胶支架呈多级微孔结构;(2)含胶质瘤细胞的3D水凝胶支架结构可持续培养14天以上,细胞维持较高活性,逐步生长成类组织球体;(3)活/死细胞染色、显微镜和电镜观察3D培养胶质瘤模型,细胞存活率维持在(85.23±6.21)%;(4)通过RNA测序,筛选出大量差异表达基因,其中耐放射相关基因ITGA2表达具有显著差异;(5)qRT-PCR和Western Blot验证明确ITGA2在3D胶质瘤模型中过表达;(6)经放射治疗后,平板克隆实验结果显示3D培养胶质瘤模型比2D模型更加耐受放射治疗(SER=0.92);(7)qRT-PCR和Western Blot证实ITGA2在3D胶质瘤模型中过表达,可能参与到该模型的耐放疗作用;(8)shRNA成功干扰ITGA2表达后,3D胶质瘤模型的耐放射能力较对照组显著降低(P<0.01);(9)通过KEGG数据分析及蛋白相互作用预测提示ITGA2与AKT的表达具有直接相关性,通过Western Blot验证,结果提示ITGA2过表达可上调p-AKT的表达水平,推测ITGA2过表达上调p-AKT参与3D胶质瘤模型的耐放疗。结论:通过海藻酸钠/明胶/纤维蛋白原水凝胶体系,成功制备了 3D培养脑胶质瘤模型,与2D培养胶质瘤模式相比,胶质瘤细胞的基因表达谱具有显著差异,初步证明ITGA2通过影响AKT的活化在3D培养脑胶质瘤模型耐放疗作用中发挥作用。