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背景 集落刺激因子1受体（colony stimulating factor 1 receptor， CSF-1R）是c-fms癌基因编码的产物，在肝癌发生过程中呈高表达状态，但表达的机制尚不清楚。CSF-1R具有酪氨酸激酶活性，通过多信号传导途径影响肝癌的发生发展。人CSF-1R第301位密码子含有一活化的突变位点，该位点一旦发生正常的亮氨酸Leu（TTG）→丝氨酸Ser（TCG）置换后，CSF-1R可模拟其配体CSF-1诱导的构象变化，导致CSF-1R酪氨酸激酶自身的失控性激活，通过一系列信号传导机制导致细胞的生长分化异常，最终导致肿瘤发生。人CSF-1R第969位酪氨酸及其附近的氨基酸，对CSF-1R酪氨酸激酶活性具有负性调节作用，当该位点发生缺失或突变后，可上调CSF-1R酪氨酸激酶活性，通过前述信号传导机制参与肿瘤的发生。目前研究认为，癌基因低甲基化是导致其异常高表达的一种重要分子机制。部分癌基因编码的产物是生长因子和/或生长因子受体，癌基因通过低甲基化机制表达大量的生长因子/生长因子受体，通过自分泌/旁分泌机制促进肝癌的发生发展。人CSF-1R第571位酪氨酸对CSF-1R酪氨酸激酶的激活及信号转导是必须的。反义基因作为肝癌的一种生物学治疗方法近年来取得了可喜的成果。AFP增强子可调控目的基因在AFP阳性的肝癌细胞中高效特异表达。诱导凋亡也是治疗肝癌的一种方法。已有实验证明抗CSF-1/CSF-1R的单抗可抑制肝癌细胞的生长，证明CSF-1/CSF-1R是肝癌发生发展中的一对自泌/邻泌系统，阻断其异常表达对肝癌治疗具有实际意义。目前关于肝癌中c-fms癌基因异常激活及高表达机制尚在探索中，迄今未见反义c-fms基因对肝癌细胞生物学行为影响的报道。 目的 观察肝癌发生过程中c．rms癌基因是否存在缺失或突变，以及它们 与肝细胞癌变的关系及意义，为进一步阐明肝癌的发生机理提供依据。 同时检测肝癌发生过程中c．rms癌基因甲基化水平的变化，以阐明c． fiYI．－－－－SF一 在肝癌组织中的异常高表达机制。通过构建人反义 C－ho真 核表达载体及携带AFP增强子的c．fms反义真核表达载体，观察两种载 体转导入肝癌细胞后对肝癌细胞生长的影响，为肝癌的基因治疗探索一 种新的方法。 ％ 1．肝癌中c－fluS癌基因突变及其临床意义 1l材料：提取经病理学证实的30例肝癌及其配对癌旁肝组织DNA， 男25例，女5例，年龄32—76岁，平均55岁。对照组织取自HBV 阴性的肾移植供体正常肝组织。 1．2引物设计：设计两对引物分别分析CSF．IR第301、969位密码子。 引物1：上游（F）：5’．GAATTCGCCA GATOCTTGTG TGTTCTGC． 3，下游（R）：5’．GTCGACGTCA CCTCCTGGAT GAGGT．3：两条 引物分别对应于C 4ifs4lls恤正链第14814—14835位和第1487卜14894 位核耷酸，可扩增产生 93hp的 DNA片段，C－fms第 301位酪氨酸 位于该片段内，上下游引物5’端分别引入EcoRI、Sail酶切位点。引 物二：上游（F）：5’七AAe＊＊＊T ATAATA＊＊＊ATC T＊＊＊O＊O丁： 下游（K）：5‘－GT＊GA＊＊＊＊G＊TA＊＊＊＊＊＊oTC 0＊＊＊·3’：两条引 物分别对应于C－nS DNA正链第34103—34122位和第34264－34283 位核昔酸，可扩增产生193hp的DNA片段，C－fms第969位酪氢酸 位于该片段内，上下游引物5’端分别引入Ec。RI、Sail酶切位点。 1．3P＊R反应：P＊R反应体系so乃卜！，含灭菌水34石pl、loxbuffer 5刀 ul、dNTP（2．srnmow）4．0 nl、上下游引物（浓度 20pmU nl）各 2．5VI气模板DN A且刀VI与T的酶（＊／VI，具有3’十5’外切酶活性）0．4 VI。扩增第301位密码子片段PCR反应参数：预变性94℃300秒； 30个循环，94℃变性60秒、55℃复性60秒、72C延伸60秒：72 ．4· C延伸300秒。扩增第969位密码子片段PCR反应参数：预变性94 ℃300秒；30个循环，94℃变性60秒、55℃复性120秒、72℃延 伸120秒；72℃延伸300秒。反应结柬后取PCR产物5刀卜！行12％ 聚丙烯酞胺凝胶电泳检测PCR产物的扩增效果及特异性。 1．4 SSCP分析：取 PCR扩增产物 10．0 ul加入碱变性液（0．smoljL NaOH、 ic。W＊＊TA）5刀卜1，在沸水中煮5分钟，迅速放入冰浴中5分 钟，加入变性上样缓冲液（95％去离子甲酚胺、10mmol／L EDTA、口．25％ 二甲苯青吓、O．25％涣酚蓝）3．0 yi。以正常肝组织为对照，正常对 照包括变性样本和非变性样本。18％聚丙烯酞胺凝胶（含 10％甘油） 10IllH恒流电泳，EB染色后拍照记录。 1．5 DNA测序：紫外透射下切割?