周围神经损伤在临床工作中比较常见,在外伤患者中,约有2.8%的病例伴有不同程度的周围神经损伤。对于短距离的神经损伤,可以通过断端直接吻合的方法来修复,但是对于长距离的神经缺损,则必须给予一个适宜生长的环境才能引导神经纤维的延伸。目前对于长距离的神经缺损通常采用移植物桥接的方式,常用的移植物主要有神经,静脉或者动脉等等。但是,这些方法都有一些不可避免的缺点,比如移植材料来源的短缺,额外的创伤以及供区的功能障碍。另外供体移植物的大小也不能很好的适应待修复的神经,异体移植的免疫排斥反应等等。而最近兴起的组织工程神经被认为是有希望的替代方案,应用组织工程的方法构建神经移植物,能够很好的解决上述的问题。对于理想的组织工程神经,要求其具有良好的生物相容性,生物降解性,并且能够引导和促进损伤神经的再生。在本文中我们先后构建了三种人工神经应用于周围神经损伤的修复。分别为PLGA复合自聚合肽纳米材料,PLGA复合自聚合肽纳米材料及施万细胞和PLGA复合有序胶原蛋白支架构建的人工神经。施万细胞(Schwann cells,SCs)是周围神经的主要结构和功能细胞,它能分泌各种神经营养因子,产生细胞外基质和细胞粘附因子,并且与多种生物材料具有良好的相容性。在我们用到的材料中自聚合肽纳米材料(self assembling peptide nanofiber scaffold, SAPNS)是最近兴起的生物材料,已经广泛应用于组织工程中。与传统材料相比,其纤维构成和孔径能够更好的模拟细胞外基质,有利于细胞的生长。PLGA全称是聚乳酸-羟基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolic acid)),具有良好的生物相容性、无毒、良好的成囊和成膜性,被广泛应用于制药、医用工程材料和现代化工业领域。在美国,PLGA通过了FDA的认证,作为药用辅料收录进美国药典。胶原蛋白是细胞外间质的重要组成部分,它的分布遍及全身各个组织器官。胶原蛋白有着诸多的优点,在生物医学中的应用甚为广泛且发展迅速,包括作为药物传递系统,外科缝线、止血剂等,在组织工程中更是一个很重要的研究材料。通过以上材料的互相结合,我们构建了三种组织工程神经,并检测了其对神经损伤再生的促进作用。材料和方法L人工神经导管的制备1.1 PLGA管的制备：将PLGA颗粒溶于三氯甲烷中搅拌24 h至均匀,制成5%的PLGA溶液,其中PLA:PGA为85：15。将相同于溶液中溶质质量的氯化钠颗粒(96-75 μ m)加入到溶液中搅拌24h后将已经配制好的溶液浆料迅速倒入聚四氟乙烯模具中成型为管状体并置于冷冻干燥机中冻干2h,将成型的导管用蒸馏水洗6次去除材料中的氯化钠颗粒,然后再用DMEM/F12培养液中冲洗3次,备用。1.2施万细胞的培养与鉴定：取两周龄大鼠,截取坐骨神经,用反复植块法培养纯化施万细胞。1.3胶原蛋白有序支架材料的制备：提取大鼠鼠尾胶原,通过冷冻干燥和物理拉伸制备内部含有有序细微管道的线性胶原支架。1.4人工神经导管的制备：PLGA+SAPNS:PLGA管内填充20μ1 SAPNS,然后在DMEM/F12培养液中浸泡30分钟,使自聚合肽聚合成为凝胶状。PLGA+SAPNS+SCs:将2.5×105个SCs混入20μ1 SAPNS,然后填充到PLGA管内,DMEM/F12培养液浸泡30mmin,使自聚合肽聚合成为凝胶状。PLGA+collagen:将上述制备的胶原支架填充到到PLGA管内,DMEM/F12培养液中浸泡30分钟,备用。2.大鼠坐骨神经缺损模型制备及人工神经导管移植： 暴露大鼠坐骨神经后切除部分神经造成10mm的缺损,用上述构建的人工神经导管进行移植修复。另设神经移植阳性对照组(peripheral nerve, PN)、单纯缺损无移植的阴性对照组(non graft, NG)和假手术组(sham)。 PN的移植物为从同种SD大鼠所取下的l0mm坐骨神经。NG只做神经缺损,不做修复处理。sham仅暴露坐骨神经但不做损伤。3.行为学功能检测：使实验动物在100cm长,宽10cm的长方体通道中行走,将其前脚掌涂无毒染料,训练其走窄跑道。动物熟练行走后进行测试三次。首先,我们分析了损伤侧后肢着地方式,然后在得到的完整足印上测量前后脚掌掌心距和脚掌与动物前进方向的夹角。4.神经电生理检测：大鼠麻醉后重新暴露坐骨神经,将刺激电极和参考电极分别置于移植物近侧端的宿主神经干,记录电极置于同侧脚掌掌心。然后记录复合肌诱发动作电位(compound muscle action potential, CMAP)。从所获得的电生理CMAP图形测量其神经传导潜伏期(latency)和复合动作电位的波幅(amplitude)。5.荧光金逆行示踪检测：电生理检测后,通过显微注射将2 ul 1%的荧光金注射于移植物远端5mm处。注射后7d,处死动物,观察标记结果。6.组织收集：注射荧光金7d后,麻醉动物,取出双侧腓肠肌称重,计算湿重比。0.1M PBS和多聚甲醛灌注,取材收集坐骨神经和L5脊髓节段。部分样本用2.5%戊二醛加2%多聚甲醛固定以备透射电子显微镜检测,4%的多聚甲醛固定以备冰冻切片和免疫荧光染色。7.免疫荧光检测：用于免疫荧光染色的样品经过4%多聚甲醛固定24 h后梯度蔗糖脱水,OCT包埋后冰冻切片,厚度20 μm,切片保存在-20℃待用。在每个组织的切片中,间隔10片取出1片,进行NF-200/MBP免疫组化双染色检测轴突和髓鞘,荧光显微镜观察和拍照。8.透射电镜观察：取移植物中段1mm标本,2.5%戊二醛和2%多聚甲醛固定24 h后,样品经过梯度丙酮脱水,在1%Os04中4℃处理2h。然后将样品用树脂包埋后进行超薄切片,2%醋酸铀和柠檬酸铅复染,用透射电子显微镜观察髓鞘和神经纤维生长情况并拍照,测量分析各组差异。9.腓肠肌组织学检测：取腓肠肌中段5mm×2mm×2 mm组织块浸入多聚甲醛固定过夜,梯度蔗糖脱水,OCT包埋剂包埋后进行冰冻切片,厚度10 μ m。隔10张取一张进行苏木素染色,光镜观察,并采用Image Pro Plus图像分析系统测量放大20倍视野下各组腓肠肌纤维面积。10.运动神经元定量分析：脊髓L5节段冰冻切片,厚度10μm。每隔10片取1片进行荧光Nissl染色标记存活神经元。统计荧光金标记的再生神经元占存活运动神经元的比例,同时根据损伤侧和正常侧神经元的比值,计算神经元存活的比例。11.运动终板检测：取固定后的中段腓肠肌,每个组织分别进行冰冻切片纵切,厚度10μm,纵切片用α-银环蛇毒素(α-BTX)染色标记运动终板。染色结果显微观察并拍照,每个标本选取六个不重叠的视野,用Image Pro Plus统计运动终板的面积和腓肠肌的肌纤维横切面积。结果1.行为学检测后肢运动功能恢复：与单纯损伤无移植的NG相比,人工神经或周围神经移植后大鼠损伤侧后肢行为学检测各项指标均有较显著的改善。提示坐骨神经有不同程度的再生使得靶区肌组织能在神经支配下恢复部分运动功能。2.神经电生理检测损伤坐骨神经传导功能：通过电生理波形分析,可见坐骨神经缺损后CMAP波形基本消失,神经导管或周围神经移植后CMAP有不同程度的恢复。其中上述人工神经导管移植组的神经传导潜伏期(latency)和复合动作电位的波幅(amplitude)的数值介于PLGA空套管组和PN之间。提示人工神经导管对恢复神经传导功能有一定的效果。3.轴突的再生情况：标本取材后可见人工神经导管或周围神经移植组的宿主神经干与移植物之间没有明显的瘢痕组织出现。将纵切片标本做NF-200免疫组化后可以看到在移植区有大量NF-200阳性的再生轴突,轴突排列比较规则,基本平行于神经长轴,大部分轴突通过移植区进入到尾侧神经干。在NF-200免疫组化染色的横切片上可以看到,再生轴突较均匀分布于整个移植的管道。4.再生轴突的髓鞘化：NF-200和MBP免疫荧光双染或透射电镜结果可见,在各组移植区横切片均可见不同程度的NF-200阳性轴突及其周围包绕的MBP阳性髓鞘。相对而言,三种人工神经导管移植区内的轴突密度和直径、轴突髓鞘化比例,以及髓鞘的厚度仍较显著低于假手术组和周围神经移植组,但显著高于PLGA空套管组。5.神经元的存活和再生：脊髓前角运动神经元发出的轴突参与了坐骨神经组成,所以坐骨神经横断可导致脊髓神经元的损伤。通过荧光Nissl染色显示神经元并将损伤侧与对照侧比较,发现运动神经元的存活率在各移植组之间没有显著性差异。同时比较荧光金阳性标记的再生神经元占存活神经元的比例,提示人工神经导管移植能显著提高再生运动神经元的比例,但与周围神经移植组间仍有差异。6.腓肠肌萎缩情况：坐骨神经缺损可导致其所支配的腓肠肌明显萎缩,肌纤维脂肪变性,在单纯损伤组由于没有有效的治疗,肌肉萎缩的情况最明显,而在各个治疗组,萎缩程度有着明显的改善。统计肌纤维的横切面积和腓肠肌的湿重比,各组差异均有统计学意义。7.运动终板的形态分析：用α-BTX标记神经肌肉接触位置的运动终板,从运动终板的面积可以看出,各组的运动终板面积都有不同程度的下降,均低于假手术组。运动终板面积减小最明显的是单纯损伤,其次是三种人工神经组,周围神经组与正常动物的差异不明显。在本实验研究中,我们设计了三种新型的组织工程人工神经材料,它是由PLGA材料构成的导管支撑,内部分别填充了自聚合肽纳米材料(SAPNS)、混合施万细胞的SAPNS和线性有序胶原支架。利用大鼠坐骨神经缺损10mm的损伤模型检测其促周围神经再生的效果,同时利用假手术、同源周围神经、PLGA空导管和单纯损伤等分别作为阳性或阴性对照。经过电生理、行为学、组织学和神经束路示踪等检测手段,评价缺损神经的轴突再生、髓鞘化、神经传导以及后肢运动功能恢复等情况。综合各项检测指标可见,本课题所构建的三种新型人工神经导管均能较好地桥接缺损的周围神经,可促进轴突再生及髓鞘化,同时神经传导功能及靶区运动功能均有不同程度的恢复。同时,本研究结果也提示,上述导管促神经再生的效果与周围神经移植组相比还有差距。本课题组将根据本研究的结果和提示,对所构建的人工神经导管进一步完善和改进,不断提高周围神经缺损修复的效果。