东北虎心脏cDNA文库构建及生物学特性分析

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东北虎(Panthera tigris altaica)分布于亚洲东北部,是现存体积最大的猫科动物亚种,全世界最濒危物种之一。长期以来,由于受到生存环境的破坏,栖息地的丧失,人类偷猎盗猎等行为的影响,致使野生东北虎处于濒临灭绝的境地。因此,开展东北虎遗传资源保护十分必要。cDNA文库对濒危野生动植物遗传资源保存具有深远的意义。本次研究材料取自2.5岁圈养东北虎心脏组织,基于现代分子生物学以及生物信息学等方法,构建了东北虎心脏组织eDNA文库,同时对文库质量和所得ESTs进行了分析,主要成果如下:  1、SMART法成功构建了东北虎心脏组织eDNA文库。心脏总RNA经反转录合成ss-cDNA后,LD-PCR合成ds-cDNA,所得双链eDNA经蛋白酶K消化和Sill I酶切后,过Chroma SPIN-400纯化柱进行分离纯化,得到的大片段cDNA与λTriplEx2载体进行连接,包装,即获得东北虎心脏组织cDNA文库。所得eDNA文库的初始滴度和扩增后的滴度分别为2.69×106 pfu/mL和4.96×109p fu/mL,文库重组率为93.47%,说明扩增后的文库具有较大的库容量且仍然拥有较高的品质。文库插入片段平均长度为795bp。  2、随机挑选160个克隆进行测序,测序结果通过GENE BANK中的BLAST等初步处理比对后,获得129个原始序列,去除低质量后得到108个有效序列,序列长度主要集中在750~1000bp之间,测序成功率达到80.6%。  3、对所得序列进行GO分析、蛋白质分类和通路分析。细胞组分序列比例最大为19.7%,分子功能中具有催化活性功能的序列比例最大为47.9%,生物学过程中在代谢过程中起作用的序列比例最大为59.2%,蛋白分类中水解酶序列比例最大为15.5%,对序列进行代谢途径分析,参与整合蛋白信号通路的序列比例最大为7%。  4、对所得有效序列进行基因关系分析,获得了基因关系网。结合GO注释、代谢途径分析以及相关文献的阅读,筛选出与东北虎代谢、心脏发育相关的中心基因进行功能分析,为东北虎种群遗传资源保存、繁殖能力的提高以及疾病的预防奠定了基础。
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