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肺纤维化是以弥漫性间质纤维化为特征的一类疾病,其中50%以上原因不明,称之为特发性肺纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)。肺纤维化预后较差,治疗不敏感,肺移植是目前终末期肺纤维化患者唯一有效的治疗方法。肺纤维化致病机制不明,可能和肺损伤后炎症反应以及异常修复有关。肺纤维化是肺损伤的重要阶段,肺损伤后的修复大致可分为三个阶段：炎症反应期,肉芽组织生成和细胞外基质沉积期,基质重构和肉芽组织分界期。损伤发生后,宿居的成纤维细胞活化,纤维细胞也被募集到损伤部位,并分化为平滑肌动蛋白a (a-SMA)阳性的肌成纤维细胞,使细胞外基质蛋白沉积,以促进损伤修复和组织的完整性。有研究发现Ⅱ型肺泡上皮细胞反复的损伤修复,标志性的出现在IPF患者和肺纤维化动物模型中,纤维化标记物a-SMA、I型胶原(collagen-Ⅰ)等表达上调,同时上皮细胞骨架重建变为纺锤形,最终转化为间叶细胞。肺脏损伤修复的结果是纤维化还是恢复正常解剖结构,取决于肺泡内渗出物及细胞外基质蛋白沉积能否有效清除,过多的细胞外基质蛋白沉积可导致组织纤维化。促炎性因子TNF-a在肺纤维中起关键作用。早先研究发现,TNF-a参与肺损伤后修复,在肺损伤后组织中高表达,且与肺损伤程度相关。TNF-a可直接或间接通过受体,刺激胞外基质沉积,并上调纤维化标志物Ⅰ型胶原和a-SMA的表达。进一步研究发现,TNF-a通过跨膜受体激酶,调控核内靶基因的转录,在肺纤维化中引起肌成纤维细胞的增殖分化,是肺纤维化的重要致病途径。非活性的菱形蛋白2(inactive rhomboid-like protein2, IRHOM2)属于rhomboid蛋白家族,目前发现的rhomboid蛋白家族成员丰富,有十余种,参与细胞内外的信号转导,如rhomboid家族中的RHBDD3可抑制NK细胞TLR3通路的活化。Freeman等人研究发现IRHOM2是抗病原体防御和睡眠的调控蛋白。在微生物入侵时,巨噬细胞等会分泌TNF-a,并且将其转移到胞膜处,而后胞膜处的肿瘤坏死因子转化酶(tumor necrosis factor-a converting enzyme, TACE)会促进TNF-a的释放。IRHOM2可以和内质网中的TACE蛋白结合,促进TACE离开内质网到达胞膜发挥功能。所以,抑制IRHOM2蛋白表达,可导致TACE无法成熟,不能发挥以上功能。另外,有研究表明Rhbdf2(编码IRHOM2)敲除小鼠关节炎症明显减轻,关节肿胀减轻、临床评分降低,滑液验证关节侵蚀减轻,说明IRHOM2在关节炎症中的作用。因此,IRHOM2可能通过TNF-a信号通路调控小鼠肺纤维化。通过研究观察博来霉素诱导的野生小鼠肺组织及肺细胞中IRHOM2变化,以及调控肺泡上皮细胞中IRHOM2来观察上皮间质化的程度,有利于阐明IRHOM2在肺纤维化中的作用机制,为临床寻找干预肺纤维化提供新的线索和靶点,为防治肺纤维化提供理论依据和临床策略。第一部分小鼠肺纤维化对肺组织及细胞IRHOM2及TNF-a的影响小鼠肺纤维化对肺组织中IRHOM2及TNF-a的影响目的：建立小鼠肺纤维化模型,研究小鼠肺纤维化对肺组织中IRHOM2及TNF-a的影响方法：C57BL/6小鼠随机分为2组(n=6),对照组(Con)、肺纤维化组(Fb)。模型组于第1天经气管给予盐酸博来霉素(4mg/kg),对照组经气管给予生理盐水(2ml/kg),第14天后取肺组织,通过心尖动脉血气分析,肺叶组织HE及Masson病理学染色检查,肺叶组织羟脯氨酸含量检测,肺叶组织湿干重比,测定评估肺功能改变及小鼠肺纤维化程度,并收集小鼠肺泡灌洗液(BALF) ELISA测定TNF-a水平,免疫组化法染色测定Ⅰ型胶原(collagen-Ⅰ)、X平滑肌动蛋白(a-SMA)、纤维连接蛋白(FN)在肺组织中含量,Western Blot方法检测a-SMA、collagen-Ⅰ以及IRHOM2蛋白,进一步评价IRHOM2及其他相关蛋白在小鼠肺纤维化中的表达情况。结果：与对照组相比,肺纤维化组给药后第14天成功诱发小鼠肺纤维化,心尖部动脉血氧分压降低,肺泡结构大面积实变,肺泡腔缩小,遍布成纤维细胞,Masson染色可见大量蓝色胶原纤维,肺叶羟脯氨酸含量及湿干重比增加,肺泡灌洗液中TNF-a增加；免疫组化显示collagen-Ⅰ、a-SMA和FN在肺组织中含量增加；Western Blot显示小鼠肺纤维后肺组织IRHOM2蛋白含量降低collagen-Ⅰ和a-SMA增加。结论：盐酸博来霉素致小鼠肺纤维化可以上调小鼠肺组织和肺泡灌洗液中TNF-a的含量,但IRHOM2蛋白水平降低。小鼠肺纤维化对Ⅱ型肺泡上皮细胞及肺泡巨噬细胞中IRHOM2及TNF-a的影响目的：小鼠肺纤维化对Ⅱ型肺泡上皮细胞(AT-Ⅱ)和肺泡巨噬细胞(AM)中IRHOM2、TNFF-a的影响方法：C57BL/6小鼠随机分为2组(n=6),对照组(Con)、肺纤维化组(Fb)。模型组于第1天经气管给予盐酸博来霉素(4mg/kg),对照组经气管给予生理盐水(2ml/kg),于第14天在戊巴比妥麻醉下,分离提取原代肺泡巨噬细胞和原代Ⅱ型肺泡上皮细胞,纯化后细胞孵箱培养。1、肺泡巨噬细胞纯化后ELISA检测细胞和培养液中TNF-a的含量。2、原代Ⅱ型上皮细胞纯化培养24 h后,检测细胞和培养液中TNF-a的含量。3、Western Blot方法检测原代肺泡巨噬细胞和原代Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2蛋白的含量变化。结果：与对照组相比,1、肺纤维化组小鼠肺泡巨噬细胞及其细胞培养液中TNF-a的含量增加。2、Ⅱ型肺泡上皮细胞培养液中TNF-a的水平降低。3、肺纤维化组小鼠肺泡巨噬细胞中IRHOM2蛋白水平增加,Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2蛋白水平降低。结论：小鼠肺纤维化可以上调肺泡巨噬细胞及培养液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平增加；同时下调Ⅱ型肺泡上皮细胞培养液中TNF-a的含量,并使IRHOM2蛋白水平减少。第二部分引起Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2变化的主要因素及IRHOM2在上皮间质转化(EMT)中的作用目的：研究肺纤维化中,主要引起小鼠Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2变化的原因,并研究IRHOM2蛋白在肺纤维化主要细胞机制——上皮间质转化中的作用。方法：C57BL/6小鼠随机分为4组(n=6),对照组(AT-Con)提取纯化原代Ⅱ型肺泡上皮细胞和肺泡巨噬细胞,并用巨噬细胞纯化后培养上清液培养Ⅱ型肺泡上皮细胞；纤维化因子组(AT-Fb)用肺纤维化小鼠巨噬细胞培养上清液培养Ⅱ型肺泡上皮细胞；博来霉素组(AT-BLM)则在巨噬细胞培养上清中加入博来霉素培养Ⅱ型肺泡上皮细胞；TNF-a组(AT-TNF)则在巨噬细胞培养上清中加入TNF-a培养Ⅱ型肺泡上皮细胞。Western Blot方法检测4组Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2含量的变化。培养人Ⅱ型肺泡上皮A549细胞系平均接种六孔板中分为3组(n=3),对照组(A-Con)为1640培养液；上皮间质化组(A-EMT)在其1640培养液中加入盐酸博来霉素,IRHOM2蛋白敲减组(A-RNAi)则为慢病毒转染A549细胞,转染后细胞中IRHOM2蛋白明显下调,并在其1640培养液中加博来霉素培养。24 h后提取细胞蛋白, Western Blot方法检测三组间代表上皮间质化水平的collagen-Ⅰ和a-SMA含量。结果：培养24 h后Western Blot结果显示,与对照组相比,博来霉素组Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2蛋白含量变化不明显,而纤维化因子组及TNF-a组中Ⅱ型肺泡上皮细胞中IRHOM2蛋白明显降低。Western Blot检测结果显示,与对照组相比,上皮间质化组细胞中collagen-Ⅰ和a-SMA含量增加,IRHOM2蛋白敲减组间质化程度介于对照组与上皮间质化组之间。结论：提示参与改变肺泡上皮细胞中IRHOM2表达量的直接因素可能是肺纤维化小鼠巨噬细胞培养液中的炎性因子,而非博来霉素,并且在上皮间质化细胞模型中,IRHOM2敲减可以下调Ⅱ型肺泡上皮细胞EMT指标,提示可缓解纤维化程度。