论文部分内容阅读
目的： 蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，糖链的改变会直接影响蛋白的结构和生物学功能，目前众多研究表明糖基化修饰与肿瘤有着密切的关系，糖基化异常的基础是糖基转移酶的异常，因此对糖基转移酶的研究已成为肿瘤研究的又一热点。岩藻糖基转移酶（FucTs）催化蛋白的岩藻糖基化修饰，与肿瘤的发生发展密切相关；α-1,2岩藻糖基转移酶II（FUT2）是该家族成员之一，本课题组的前期研究显示其在肺腺癌中呈高表达状态，与肺腺癌的发生发展和转移有着密切关系，但其具体作用机理尚不清楚。本实验以A549细胞为研究对象，探讨FUT2对肺腺癌迁移和凋亡的影响以及与经典Wnt/β-catenin信号通路和Notch信号通路的相关性，明确FUT2在肺腺癌迁移和凋亡中的作用机制，进一步为肺腺癌的诊断及治疗提供潜在的标靶。 方法： （1）利用脂质体转染技术把FUT2的RNA干扰质粒pGPU6/GFP/Neo-FUT2和对照载体pGPU6/GFP/Neo-shNC转入肺腺癌细胞A549中，经过抗性药物筛选，构建FUT2低表达的A549稳转细胞株。 （2）采用Transwell基质胶实验检测肺腺癌A549细胞的迁移侵袭能力；平板克隆实验检测肺腺癌A549细胞生长能力；流式细胞仪检测肺腺癌A549细胞周期分布情况和凋亡情况。 （3）采用Western Blot检测细胞相关黏附因子β-catenin和Icam-1的蛋白表达情况，以及 Wnt信号通路中GSK3β、磷酸化β-catenin和下游因子CyclinD1、C-myc的蛋白表达情况。 （4）采用膜浆分离和核浆分离检测Wnt经典信号通路中关键核心因子β-catenin在细胞膜、浆、核中的蛋白分布情况。 （5）采用Western Blot检测细胞相关凋亡因子Bcl-2、P53、Caspase3及其剪切体、PARP及其剪切体的蛋白表达情况。 （6）建立裸鼠皮下成瘤模型：将100μL4×107/mL A549细胞悬液通过裸鼠腹部右侧皮下注射于BALB/c-nu裸鼠皮下。6周后取出肿瘤组织，观察，测量，称重以及免疫组化检测组织中FUT2的蛋白表达水平。 （7）采用Western Blot检测Notch信号通路受体剪切体NICD和下游因子HES1的蛋白表达情况。 （8）免疫共沉淀（Co-IP）实验检测FUT2与NICD的相互作用关系。 （9）用Notch信号通路抑制剂FLI-06处理后，Western Blot检测NICD和下游因子HES1的蛋白表达情况以及其它相关因子GSK3β和磷酸化β-catenin蛋白表达情况。 （10）用Notch信号通路抑制剂FLI-06处理高表FUT2后的A549细胞，Western Blot检测NICD和下游因子HES1的蛋白表达情况。 结果： （1）经过药物的筛选成功得到稳定表达的细胞株，实时荧光定量PCR（RT-PCR）和Western Blot对目的基因和蛋白的检测结果显示：转入RNA干扰组与未转染组、空载组相比，FUT2的mRNA水平和蛋白水平表达均降低。 （2）Transwell基质胶实验结果表明低表FUT2后，细胞迁移侵袭能力显著降低；平板克隆实验结果表明FUT2低表组与空载组相比细胞生长克隆能力降低；流式细胞仪检测结果表明FUT2低表组A549细胞处在S期和G2期的比例明显降低，且细胞凋亡率增加。 （3）细胞黏附因子β-catenin的总表达量在FUT2低表达细胞中不变，而磷酸化的β-catenin的表达量升高且Wnt/β-catenin经典信号通路的GSK3β上升，下游靶因子 CyclinD1、C-myc在FUT2低表组中均显著下调。 （4）膜浆核分离检测结果表明β-catenin在细胞膜分布增高、核分布降低。 （5）在FUT2低表细胞中，细胞凋亡因子Bcl-2的蛋白表达水平下降而P53的蛋白表达水平上升，Caspase3的蛋白表达水平下降，其剪切体（cleaved Caspase3）增多，PARP的剪切体cleaved PARP也增多。 （6）裸鼠皮下成瘤模型结果显示，干扰FUT2的表达之后，皮下瘤组织生长明显减慢，6周后的瘤组织的体积和重量也较低。 （7）Notch信号通路中FUT2低表组的NICD蛋白表达水平下降，且其下游因子HES1的蛋白表达水平也下降。 （8）免疫共沉淀（Co-IP）实验结果表明FUT2与NICD存在相互作用。 （9）FLI-06抑制剂作用于A549后，NICD和下游因子HES1的蛋白表达水平下降，GSK3β和磷酸化β-catenin蛋白表达水平上升。 （10）在FUT2高表后的A549细胞中，NICD和下游因子HES1的蛋白表达水平上升，用FLI-06抑制剂处理高表FUT2的A549细胞，NICD和下游因子HES1的蛋白表达水平下降。 结论： 本实验成功构建了FUT2低表达肺腺癌A549细胞株，实验结果表明低表FUT2能抑制肺腺癌细胞A549的生长和迁移，促进细胞凋亡。FUT2可能是通过影响β-catenin的磷酸化及其在细胞内的分布，导致Wnt/β-catenin信号通路激活进一步调节肺腺癌的发生发展和迁移。同时，FUT2与Notch通路受体NICD存在相互作用关系且FUT2参与调控NICD和HES1的表达，表明FUT2可能是通过调控Notch信号通路来影响肺腺癌的凋亡。