尿路感染是常见的感染性疾病,是儿童中最常见的感染性疾病之一。在临床上,尿路致病性大肠杆菌（UPEC）是引起尿路感染的主要致病菌。尿路致病性大肠杆菌的主要毒力因子有菌毛、溶血素、铁获取系统等。其中菌毛是尿路致病性大肠杆菌的最主要的毒力因子。尿路致病性大肠杆菌的菌毛主要包括1型菌毛、P菌毛和Curli菌毛,菌毛介导细菌的多种功能,其中,菌毛黏附于尿路上皮表面是尿路致病性大肠杆菌定植到泌尿道的第一步。八正散是治疗湿热淋证的代表方,临床上主要用来治疗湿热下注引起的泌尿道感染。本研究从尿路致病性大肠杆菌菌毛的黏附功能出发,基于细菌黏附从细菌和宿主两个方面探讨八正散对尿路致病性大肠杆菌的抑菌机制,从而阐明八正散治疗尿路感染的作用机制。1八正散对尿路致病性大肠杆菌的抑菌作用研究目的:构建尿路感染体外模型,从尿路感染体外模型探讨八正散对尿路致病性大肠杆菌的抑菌作用。方法:采用常量肉汤稀释法测定八正散对尿路致病性大肠杆菌的最小抑菌浓度,然后绘制生长曲线,测定八正散对尿路致病性大肠杆菌生长曲线的作用,使用软琼脂平板检测八正散对尿路致病性大肠杆菌滑行运动能力的作用。使用CCK-8法检测八正散对膀胱上皮细胞T24的细胞毒。在低于细胞毒的浓度下,采用黏附实验和侵袭实验测定八正散对尿路致病性大肠杆菌黏附能力和侵袭能力的作用,采用透射电镜观察八正散对尿路致病性大肠杆菌菌毛和鞭毛结构的改变,采用结晶紫染色法和激光共聚焦显微镜检测八正散对尿路致病性大肠杆菌生物膜形成的作用。结果:八正散在400 mg/m L的浓度下均没有抑制尿路致病性大肠杆菌的生长的能力,提示八正散对尿路致病性大肠杆菌没有直接的抑菌能力。在8 mg/m L浓度下的八正散不能改变尿路致病性大肠杆菌的生长速度。在细菌滑行运动实验中,1 mg/m L浓度的八正散能够抑制尿路致病性大肠杆菌在软琼脂平板上的扩散。CCK-8法检测得出八正散在1 mg/m L浓度以下对T24细胞均没有细胞毒。在黏附和侵袭实验中,100μg/m L、500μg/m L和1 mg/m L浓度的八正散均能够预防和抑制尿路致病性大肠杆菌对T24细胞的黏附和侵袭,且呈浓度依赖形式,浓度越高,抑制能力越强。透射电镜结果发现,在1 mg/m L浓度的八正散作用后,尿路致病性大肠杆菌的菌毛和鞭毛结构均被破坏,菌体表面变得光滑。结晶紫染色法和激光共聚焦结果提示,在500μg/m L和1mg/m L浓度的八正散作用能够抑制尿路致病性大肠杆菌生物膜的形成,且呈浓度依赖形式,浓度越高,抑制能力越强。结论:八正散对尿路致病性大肠杆菌没有直接的抑菌作用,能够抑制尿路致病性大肠杆菌在软琼脂平板上的滑行运动能力。在低于细胞毒浓度下,八正散能够预防和抑制尿路致病性大肠杆菌对膀胱上皮细胞的黏附和侵袭,破坏尿路致病性大肠杆菌的菌毛和鞭毛结构,抑制尿路致病性大肠杆菌生物膜的形成。2八正散抑制尿路致病性大肠杆菌黏附和生物膜的机制研究目的:基于转录水平从尿路致病性大肠杆菌和宿主细胞两方面探讨八正散抑制尿路致病性大肠杆菌黏附和生物膜的潜在作用机制。方法:采用转录组学方法检测八正散对尿路致病性大肠杆菌全基因的作用。然后使用RT-q PCR检测八正散对尿路致病性大肠杆菌菌毛和生物膜相关基因的作用,使用RT-q PCR检测八正散对尿路上皮细胞黏附相关受体基因表达的作用。结果:在转录组学结果中,八正散组与对照组相比,有601个差异表达基因,其中316个上调基因,285个下调基因。差异表达基因的富集结果分析,八正散对尿路致病性大肠杆菌的主要作用途径有:碳水化合物分解代谢过程、磷酸转移酶系统、果糖和甘露糖代谢和生物膜形成等。RT-q PCR分析后与转录组学结果进行对比,Fim A、Fim D、Fim E、Fim F、Csg A、Csg F、Pap F等基因表达与转录组学结果基本一致。另外,八正散能够降低膀胱上皮细胞黏附受体Integrinα3、Integrinβ1和尿空斑蛋白UPIa、UPIb的表达。结论:八正散能够抑制尿路致病性大肠杆菌菌毛基因的表达,尿路致病性大肠杆菌转录组学结果提示,八正散能够激活磷酸转移酶系统、果糖和甘露糖代谢和生物膜形成等通路来抑制尿路致病性大肠杆菌的黏附和生物膜的形成。八正散能够抑制尿路上皮黏附受体的表达,提高宿主细胞防御能力,抑制尿路致病性大肠杆菌的黏附。3八正散对尿路感染动物模型的治疗作用研究目的:构建尿路感染小鼠模型,研究八正散对尿路感染小鼠的治疗效果,体内实验评价八正散对尿路感染的治疗作用。方法:构建尿路感染小鼠模型,分组后予不同浓度的八正散灌胃给药。治疗5天后统计各组小鼠的死亡率和体重变化,采用平板菌落计数法评价给药第1、3、5天的尿液中菌数的变化。将各组小鼠处死取材后,采用平板菌落计数法评价治疗5天后各组小鼠膀胱和肾脏中的菌数差异。通过肉眼观察并拍照记录各组小鼠膀胱和肾脏形态的差异,然后通过HE染色评价八正散对尿路感染小鼠膀胱和肾脏病理的改变。结果:与模型组相比,八正散治疗5天后,小鼠的死亡率降低,八正散低剂量组小鼠平均体重高于模型组,八正散中剂量组和高剂量组小鼠体重低于模型组。八正散高中低剂量组小鼠的尿液、膀胱和肾脏中的菌数低于模型组。肉眼观察模型组小鼠的膀胱充血明显,八正散各组的小鼠膀胱充血程度较模型组比明显减轻,各组小鼠肾脏形态无明显变化。与模型组相比,八正散各组小鼠的膀胱和肾脏病理损伤明显减轻。结论:八正散能够减少尿路感染小鼠的死亡率,降低尿路感染小鼠尿液、膀胱和肾脏中的菌数,改善尿路感染小鼠膀胱和肾脏的病理损伤情况。4八正散对尿路感染动物模型的作用机制研究目的:从泌尿道宿主角度出发,筛选出尿路感染相关的治疗靶点和生物学通路,然后体内和体外两个方面探讨八正散治疗尿路感染的作用机制。方法:采用生物信息学方法对在线数据库中的组学结果进行综合分析,找出与尿路感染相关的靶点和生物学通路。在动物实验中,使用ELISA法检测小鼠膀胱和肾脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-6的表达,使用蛋白免疫印记检测小鼠膀胱组织中NF-κB和Integrinα3、β1的表达。在细胞实验中,构建NF-κB p65过表达载体,然后检测过表达p65后,八正散对TNF-α、IL-1β、IL-6的作用。使用蛋白免疫印记检测过表达p65后宿主黏附受体Integrinα3、β1和尿空斑蛋白UPIa、UPIb的表达情况,过表达p65后,检测八正散对宿主黏附受体Integrinα3、β1和尿空斑蛋白UPIa、UPIb的表达的作用。结果:生物信息学方法分析出TNF-α、IL-1β、IL-6、NF-κB是尿路感染的关键靶点,TNF信号通路是富集到的主要通路。动物实验中,与模型组相比,八正散各剂量组小鼠膀胱和肾脏中的TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显降低。与模型组相比,八正散高剂量组的NF-κB的蛋白表达明显降低,Integrinα3、β1的表达明显降低。细胞实验中,过表达NF-κB p65后TNF-α、IL-1β、IL-6水平明显上升,八正散作用后TNF-α、IL-1β、IL-6的水平显著降低。过表达NF-κB p65促进了Integrinα3、β1的表达,八正散作用后能够降低Integrinα3、β1的表达。过表达NF-κB p65促进了尿空斑蛋白UPIa、UPIb的表达,八正散作用后能够降低了尿空斑蛋白UPIa、UPIb的表达。结论:在尿路感染中,炎症与尿路致病性大肠杆菌的黏附具有密切关系。八正散能够通过降低尿路感染的炎症水平,来降低宿主与尿路致病性大肠杆菌有关的黏附受体的表达,从而抑制尿路致病性大肠杆菌对宿主的黏附,达到治疗尿路感染的作用。