研究背景及目的胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)是脑肿瘤中最常见和最致命的恶性肿瘤,占所有脑肿瘤的17%,每年有超过10,000个新的GBM病例在美国被诊断,据文献报道,国内胶质瘤年发病率约为3~6人/10万人,且近三十年来发生率逐年递增,在35岁以下肿瘤患者中死亡率排名第二。GBM跟其他脑肿瘤相比同样会导致癫痫、恶心、呕吐、头痛和轻微偏瘫,其中最重要的症状是不断恶化的记忆、性格或神经衰退。GBM预后不佳,具有很高的致死率,其主要原因是由于胶质瘤细胞具有高侵润性和转移性。据统计,51%的薄壁组织脑肿瘤和20%的颅内脑肿瘤都是GBM。近些年来,针对GBM的治疗虽然在手术、化放疗方面取得了很大进步,但关于GBM细胞的高侵袭性机制、血脑屏障对GBM细胞的影响、GBM生长机制与发生发展的个体差异等问题仍然需要回答。炎症反应在肿瘤的发生、癌细胞的增殖、血管的生成、肿瘤细胞的侵袭和转移等方面起关键作用。与肿瘤相关的炎症的典型特征是先天免疫细胞(如小胶质细胞和巨噬细胞)的浸润、细胞因子和趋化因子的产生,组织重塑和血管生成。炎症反应一方面诱导氧和氮自由基的产生,破坏细胞DNA和膜结构;另一方面激活与癌细胞生长、发展以及侵袭相关的细胞信号通路。线粒体是哺乳动物体内除细胞核外唯一含有遗传信息的细胞器。它们不断地通过分裂、融合、出芽以及亚结构的改变,进行遗传物质交换、形态及数量变化。有研究发现,线粒体分裂和融合的稳态与肿瘤的增殖有一定相关性,但这种线粒体分裂和融合的稳态在GBM细胞中的起何种作用尚未见相关报道,因此明确线粒体的形态、结构和功能变化与胶质瘤发生发展的相关性十分必要。细胞自噬是真核生物代谢的一个重要环节,以清除受损或多余的细胞器或蛋白质。近些年对自噬的研究取得了一定的进展,但自噬在肿瘤发生发展及侵润过程中起促进作用还是抑制作用至今尚未见定论。另外炎症环境中,GBM细胞内线粒体是否存在自噬、线粒体稳态有无异常、以及线粒体功能是否发生紊乱尚未见报道。因此,本研究通过细胞培养、蛋白质印记、免疫组化、免疫荧光、流式细胞术、质粒转染和透射电镜等主要技术手段研究:胶质瘤细胞中线粒体的形态、生物学性能以及质量控制与炎症的关系,为进一步揭示GBM的发病机制,寻求有效的治疗方法提供实验依据。材料和方法第一部分:促炎因子刺激对胶质瘤细胞中线粒体形态学的影响1.对各级别胶质瘤组织切片进行Ibal免疫组化染色,观察各级胶质瘤中小胶质细胞的形态和分布的变化。2.对各级别胶质瘤组织切片进行IL-6免疫组化染色,观察在各级胶质瘤中促炎因子IL-6的表达情况。3.用促炎因子LPS和IFN-γ联合刺激U87-MG细胞,分为0h、4h、8h、24h组,进行Western Blotting(WB)和细胞免疫荧光检测Drp1、Mfn2与Hsp60蛋白表达量的改变,以及线粒体形态的改变。第二部分:促炎因子刺激对胶质瘤细胞中线粒体生物学性能的影响1.使用活性氧(ROS)检测试剂盒检测在LPS和IFN-γ联合刺激下,胶质瘤细胞中ROS的变化。2.使用4-羟基壬烯酸(HNE)标记细胞脂质过氧化,观察在LPS和IFN-γ联合刺激下U87-MG中线粒体膜脂质过氧化水平的变化。3.使用线粒体膜电位检测试剂盒(JC-1)检测在LPS和IFN-γ联合刺激下,U87-MG中线粒体膜电位的改变。4.使用NAC(N-Acetyl-L-cysteine)作为ROS抑制剂,抑制促炎因子刺激下U87-MG中ROS的产生,观察线粒体形态的变化。第三部分:促炎因子刺激胶质瘤细胞中线粒体的质量控制1.使用LC3B标记细胞自噬,使用WB和细胞免疫荧光检测在LPS和IFN-γ联合刺激下U87-MG中自噬水平的变化。2.使用GFP-LC3进行质粒转染,标记细胞内的自噬体,检测在LPS和IFN-γ联合刺激下U87-MG中自噬水平的变化。3.使用LC3B和Mito Tracker进行特异性荧光共定位,检测自噬体与线粒体的共定位情况。4.使用LAMP1标记溶酶体,Mito Tracker标记线粒体,检测溶酶体和线粒体的共定位情况。研究结果1.随着胶质瘤级别的增加,Iba1阳性的小胶质细胞的胞体增大,突起回缩,表现出明显活化状态;2.随着胶质瘤级别的增加,IL-6的表达也随之增加;3.用LPS和IFN-γ联合刺激U87-MG后,1)4h组和8h组线粒体明显发生断裂,由管状变成球状或短棒状;2)ROS的表达量增强,未发现明显的线粒体膜脂质过氧化;3)线粒体膜电位明显下降;4.LPS和IFN-γ联合刺激后,用NAC抑制U87-MG中ROS的产生,具有球形形态线粒体的细胞比例明显减少;5.LC3B细胞免疫荧光和WB结果以及GFP-LC3质粒转染结果均显示:LPS和IFN-γ联合刺激后,U87-MG中自噬水平显著提高;6.LPS和IFN-γ联合刺激未引起U87-MG中线粒体与自噬体共定位量的明显改变;7.LPS和IFN-γ联合刺激未引起U87-MG中线粒体与溶酶体共定位量的明显改变。结论1.促炎因子LPS和IFN-γ联合刺激可影响U87-MG细胞线粒体的形态结构,使线粒体发生断裂,环状线粒体增加;2.促炎因子LPS和IFN-γ联合刺激对U87-MG细胞线粒体的膜电位产生一定影响,使线粒体膜电位下降。