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目的:克隆大鼠gremlin基因,研究gremlin高表达对体外培养的大鼠肝星状细胞生长和活化的影响。本研究的目的是基于gremlin对大鼠肝星状细胞活化影响的研究,初步了解认识gremlin在肝纤维化病变过程中的可能作用机制,为肝纤维化分子发病机制的研究提供一定的研究基础。 方法:(1)Nest-RT-PCR克隆大鼠gremlin基因编码区,将其克隆入真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达质粒 pcDNA3.1(+)/rgremlin。用pcDNA3.1(+)/rgremlin转染HSC-T6细胞,获得稳定高表达 gremlin的细胞株。(2)MTT法检测高表达gremlin对HSC-T6细胞生长增殖的影响;流式细胞术检测高表达gremlin对细胞周期的影响;细胞免疫荧光法检测细胞内gremlin和α-SMA表达;Western blotting检测细胞内α-SMA和胶原蛋白含量。(3)RT-PCR、Western blotting和荧光素酶报告分析法检测纤维化相关信号转导分子。 结果:(1)成功克隆大鼠gremlin基因编码区,构建了gremlin真核表达质粒,并获得高表达gremlin的HSC-T6细胞株(19＃)。(2)MTT和流式细胞术检测结果显示,与对照细胞相比较,高表达gremlin能抑制HSC-T6细胞的生长;Western blotting分析结果显示,高表达gremlin能增强HSC-T6细胞的活化。(3)Western blotting检测结果表明,高表达 gremlin可增强TGF-β及其下游信号转导蛋白p-smad2/3的表达,同时抑制smad7的表达;RT-PCR法检测结果表明,高表达gremlin降低细胞内BMP7信号分子的mRNA水平;荧光素酶报告分析和RT-PCR的结果显示:高表达gremlin抑制星状细胞内 NF-κB表达,另外还发现,高表达gremlin后,HSC-T6细胞内Notch1和Notch2的mRNA和蛋白质水平均出现明显下调。 结论:在gremlin高表达的细胞模型中,HSC-T6细胞的生长受到抑制,HSC-T6细胞的活化程度增强,gremlin活化HSC-T6细胞的机制可能有:增强TGF-β信号转导,抑制BMP7信号通路,TGF-β信号转导与Notch信号通路交联也可能参与了HSC的活化。