霍乱弧菌是霍乱的病原体,广泛存在于海洋及江河入海口环境中。在恶劣环境中霍乱弧菌会以活的非可培养(Viable but non-culturable state, VBNC)状态维持生存,此时常规分离方法检测不到,在环境条件合适时,VBNC状态的霍乱弧菌会复苏为活跃增殖的可培养状态。因此,VBNC状态是霍乱弧菌的一种应激生存方式,会在霍乱监测中造成漏检。本研究在实验室条件下对霍乱弧菌这一特殊的状态进行了转录组及蛋白组的分析,探索霍乱弧菌进入此状态过程中的生理学变化。已有研究报道了VBNC状态与常规培养状态的转录组比较,在本研究中,我们在低温和人造海水条件下、对01群El Tor型霍乱弧菌自实验室常规培养状态向VBNC状态发展过程中的连续变化进行了转录组比较。在低温低营养条件下,随着培养的时间延长,霍乱弧菌核糖体RNA (rRNA)的断裂程度也越来越强,在VBNC状态中,rRNA则主要表现为断裂小片段形式,提示细胞的蛋白质合成以及相应的生理活动变弱。对霍乱弧菌进入VBNC过程中各时间点差异转录基因的比较也显示了这一特征,随着培养时间的延长,转录下调及沉默的基因数量增多,提示细菌逐步关闭一些基因以维持生存。对差异基因的GO及KEGG Pathway富集分析表明,在霍乱弧菌VBNC发展过程中,氨基酸、脂肪酸、氨基糖及核糖等代谢增强,细菌的运动性、趋向性以及氧化磷酸化等减弱。我们比较了霍乱弧菌VBNC状态与正常培养状态的蛋白质组差异,共鉴定到1500余种蛋白,其中上调表达的87种,下调表达的239种。对这些差异蛋白的G0及KEGG Pathway富集分析表明,上调蛋白主要集中在氨基酸代谢、氨基糖和核糖代谢以及磷酸烯醇式丙酮酸转移系统(PTS)等；下调蛋白集中在核糖体组成、糖酵解/糖原异生化、嘌呤嘧啶代谢、磷酸戊糖途径、丙酮酸代谢等,其中50种下调表达蛋白参与核糖体的组成,说明VBNC状态的霍乱弧菌生理活动性弱,处于休眠状态,这也与转录组分析中看到的rRNA降解相一致。转录组分析观察到一些基因在VBNC发展过程中较大程度的转录上调,其中几丁质代谢相关基因是明显持续性上调转录的基因簇之一。分别检测其对低温和低营养的培养条件反应,发现低温是诱导该基因簇上调表达的主要因素；缺失其中的一些基因后,未发现对霍乱弧菌低温低营养条件下生存曲线和VBNC变化有明显的影响,提示该基因簇的持续转录随低温环境而出现,可能不是霍乱弧菌进入VBNC的启动和维持因素。霍乱弧菌VBNC发展过程中仍涉及碳水化合物的代谢,cAMP受体蛋白(cyclic AMP receptor protein CRP)是碳水化合物代谢基因调控中的一个重要全局调控因子。我们构建了CRP基因的缺失株,发现CRP失活的菌株在低温和人造海水中可培养的细菌数下降明显快于野生株,提示CRP在霍乱弧菌进入VBNC状态过程中、对维持细菌存活和VBNC状态发展有重要的作用。霍乱弧菌中CRP对碳源代谢的调控研究较少,本研究中我们利用高通量的代谢芯片法比较了霍乱弧菌野生株和CRP缺失株对碳源的利用,筛选到受CRP作用的24种碳源,其中11种未在霍乱弧菌和其他细菌中报道过,然后利用定量PCR和凝胶滞阻实验证实其中的腺苷、肌苷和L-天门冬氨酸的代谢受CRP直接正向调控。这些基础数据能够用于将来细致分析VBNC发展过程中哪些糖醇代谢发挥主要的作用。通过本研究,我们获得了霍乱弧菌VBNC状态发展过程中的基因转录变化,也从蛋白质组水平上得到了VBNC状态细菌的蛋白质组成特点,这些将为进一步分析霍乱弧菌进入VBNC状态的重要调控因子、以及VBNC状态发展过程中的生理活动变化提供基础数据和研究依据。