广谱苏云金芽孢杆菌(Bt)工程菌的构建及Bt抗肿瘤细胞活性研究

来源 :中国科学院研究生院 中国科学院大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:guanxing1
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苏云金芽孢杆菌(Bacillus thur ingiensis,简称Bt)对鳞翅目、鞘翅目、双翅目等害虫具有良好的特异性杀虫活性。针对目前Bt杀虫剂品种单一、杀虫谱窄、昆虫易产生抗性等一系列问题,对杀虫基因进行改造,扩大杀虫谱和提高杀虫毒力成为了目前的研究热点。   本实验室分离出两株具有高效杀虫活性的Bt菌株,其中菌株C-33能高效杀鳞翅目害虫,而菌株YM-03对鞘翅目害虫有高毒力;从C-33与YM-03中分别克隆了杀虫晶体蛋白基因cry1Ac19(AssessionNumber: DQ195217)和cry3Aa8(Assession Number: AY572010)。本研究在此基础上,为扩大杀虫谱,提高杀虫晶体蛋白毒力,构建了多株杀鳞翅目和鞘翅目害虫的Bt工程菌,其中Bt工程菌BMB171/3Aa/1Ac可同时表达Cry1Ac和Cry3Aa两种蛋白,在光学显微镜下可观察到两种形态的伴孢晶体,分别为Cry1Ac的典型菱形晶体和Cry3Aa近似方形薄片状晶体,毒力生物测定结果表明,BMB171/3Aa/1Ac孢晶混合物对鳞翅目棉铃虫和鞘翅目柳蓝叶甲的LC50分别为2.47ug/mL和1.63ug/mL。工程菌BMB171/3Aa表达了Cry3Aa蛋白,表现出较高的杀柳蓝叶甲活性,LC50为1.03ug/mL。工程菌BMB171/1Ac和BMB171/1Ac/Enhancin4分别表达了Cry1Ac及Cry1Ac和增效蛋白Enhancin的融合蛋白,二者均表现出较高的杀棉铃虫活性,LC50分别3.40ug/mL和2.10ug/mL。而工程菌BMB171/3Aa-1Ac能少量表达200kD的Cry3Aa和1Ac的融合蛋白,但对棉铃虫和柳蓝叶甲均没有活性。   一些非杀虫晶体蛋白对某些肿瘤细胞有专一的毒害作用,而对正常细胞没有毒性。利用本实验室大量的苏云金芽孢杆菌菌株资源,本研究检测了苏云金芽孢杆菌对肿瘤细胞的毒性。从318株Bt菌株中筛选出两株抗肿瘤细胞活性较好的菌株Tsh13-4和Tsh13-10。这两株菌均能引起肺癌细胞A549、早幼粒白血病细胞HL-60和宫颈癌细胞Hela的细胞病理学变化(CPE),表明这两株菌对三种癌细胞有毒性作用,且MTT细胞毒性检验显示,Tsh13-4对HL-60、A549和Hela细胞的抑制率分别为77.01%、25.50%和42.18%; Tsh13-10对HL-60、A549和Hela的抑制率分别为:72.41%、38.67%和37.04%。
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