日本毛连菜(Picris japoncia Thunb.)为菊科植物,又名枪刀菜。全草入蒙药,具有清热、消肿止痛作用。民间常口服日本毛连菜煎液防治糖尿病。课题组前期研究表明日本毛连菜水提物具有显著的降血糖作用,本文拟对日本毛连菜降血糖物质基础进行实验探索,主要研究内容包括日本毛连菜降血糖作用有效部位的筛选、日本连菜总黄酮的制备及稳定性考察、日本毛连菜总黄酮对糖尿病小鼠血糖的影响以及日本毛连菜总黄酮降血糖药效学实验及机制探讨。1.日本毛连菜降血糖作用有效部位的筛选通过比较日本毛连菜95%乙醇提取物与水提取物降血糖作用、日本毛连菜水提物不同极性部位降血糖作用、日本毛连菜不同极性部位化学成分的差异以及日本毛连菜提取物Ⅰ不同给药剂量降血糖及调节血脂作用,筛选日本毛连菜降血糖作用有效部位。结果表明,与模型组比较,日本毛连菜提取物Ⅰ低剂量显著降低四氧嘧啶致糖尿病小鼠血糖值(P<0.05,血糖值从23.06±7.41mmol/L降至13.42±2.86mmol/L),高剂量显著降低肾上腺素致糖尿病小鼠血糖值(P<0.05),降糖效果显著优于提取物Ⅱ、Ⅲ且与日本毛连菜总提物及格列本脲没有显著性差异(P>0.05)；与模型组比较,日本毛连菜提取物Ⅰ组小鼠甘油三酯、低密度脂蛋白含量显著下降(P<0.05),高密度脂蛋白含量显著升高(P<0.05)。说明日本毛连菜提取物Ⅰ(主要含有多糖和黄酮类化合物)为降血糖作用有效部位,同时日本毛连菜提取物Ⅰ具有一定的调节糖尿病小鼠血脂水平的作用。2.日本毛连菜总黄酮的制备及稳定性考察通过单因素实验,考察影响日本毛连菜黄酮提取率的主要囚素；运用正交实验设计法优化日本毛连菜总黄酮提取工艺。结果表明,日本毛连菜黄酮最佳提取工艺为使用20倍量40%乙醇在70℃水浴条件下提取2次,提取时间依次为1.5h和1h。日本毛连菜总黄酮纯化工艺考察：1)乙醇沉淀多糖的乙醇终浓度；2)大孔吸附树脂富集日本毛连菜总黄酮(树脂型号、梯度洗脱水用量,梯度洗脱乙醇浓度及用量四个方面)。结果确定纯化工艺为,使用终浓度为70%的乙醇醇沉去多糖,树脂采用非极性的D101型大孔吸附树脂,饱和上样后,首先用1.6倍柱体积水洗脱(弃),再用4倍柱体积50%乙醇洗脱(留),即得日本毛连菜总黄酮,黄酮含量达50%-53%。从日本毛连菜总黄酮的得率、纯度、指纹图谱的相似度三个方面对其稳定性进行实验研究。运用比色法测定样品黄酮含量；采用HPLC方法,以乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相进行梯度洗脱,建立日本毛连菜总黄酮指纹图谱,并采用计算机软件对色谱峰数据进行相似度评价。研究结果表明：四批样品总黄酮得率、纯度以及指纹图谱16个共有峰的相对保留时间的RSD值均小于3%,指纹图谱相似度达92%以上3.日本毛连菜总黄酮对糖尿病小鼠血糖的影响通过比较日本毛连菜总黄酮不同给药剂量对四氧嘧啶糖致尿病小鼠以及肾上腺素致糖尿病小鼠血糖的影响,确定日本毛连菜总黄酮降血糖作用及给药剂量。结果表明,日本毛连菜总黄酮能显著降低四氧嘧啶糖尿病小鼠血糖值以及肾上腺素糖尿病小鼠血糖值,降血糖的最佳给药剂量均为100mg/kg,相当于5.65g生药材/kg的给药量。通过最大给药浓度和最大给药体积两方面考察日本毛连菜总黄酮的急性毒性,结果表明,日本毛连菜总黄酮的最大给药浓度为40mg总黄酮/ml(相当于2.29g生药材/ml)最大给药体积为0.3ml/10g/次,给药一次,相当于68.7g生药材/kg,是临床人日拟用最大剂量15g生药/60kg的270倍以上,用量大于小鼠耐受人用量口服100倍,说明用药安全。4.日本毛连菜总黄酮降血糖药效学实验及机制探讨本文分析测定了日本毛连菜总黄酮对链脲佐菌素致糖尿病大鼠血糖、血脂、体重、肝重、肾重、SOD(超氧化物歧化酶)活力、MDA(过氧化产物丙二醛)含量、BUN(血尿素氮)含量的影响。结果显示,日本毛连菜总黄酮能显著降低STZ致糖尿病大鼠血糖值(p<0.05,血糖值从27.44±3.07mmol/L降至14.02±2.58mmol/L),降糖效果优于日本毛连菜水提物和提取物Ⅰ,与阳性药组比较没有显著性差异(p>0.05)；使糖尿病大鼠饮水量、摄食量减少,体重增加；显著调节糖尿病大鼠LDL-C、HDL-C含量；显著增强SOD活力和降低MDA含量,与格列本脲组没有显著性差异；显著降低糖尿病大鼠BUN含量(P<0.05)。运用HE染色技术对糖尿病大鼠胰腺、肾脏组织进行形态学观察研究结果显示,日本毛连菜总黄酮对糖尿病大鼠的胰岛、肾脏组织有有一定的保护作用。运用免疫组化技术对糖尿病大鼠肾脏中TNF-α(肿瘤坏死因子-α)和CD11a(淋巴细胞功能相关抗原)等因子的表达进行观察比较。结果显示,日本毛连菜总黄酮能显著减轻TNF-α和CD11a因子在肾脏中的表达,效果优于日本毛连菜水提物组。运用K3[Fe(CN)6]与TCA体系测定日本毛连菜总黄酮的还原能力；用邻二氮菲体系测定日本毛连菜总黄酮清除·OH自由基的能力。结果表明,日本毛连菜总黄酮在体外具有还原能力,可抑制·OH自由基的产生,其抗氧化能力与黄酮浓度呈一定量效关系。