异基因造血干细胞移植(allo-HSCT)是目前可治愈白血病、骨髓增生异常综合征等恶性血液病的最有效方法,而异基因外周血干细胞移植(allo-PBSCT)的主要优点为移植后造血重建快,感染并发症少,且避免了对供体麻醉及多部位穿刺采集骨髓细胞的不便,使供者更易接受,目前已有取代异基因骨髓移植(allo-BMT)的趋势。但由于找到人类白细胞抗原(HLA)相合供者的几率很低,尤其在我们新疆少数民族地区更为明显,而限制了其广泛的应用,很多患者则因无合适供者失去移植治疗的机会而死亡。如能跨越HLA限制建立HLA单倍体相合移植将使HSCT更广泛应用,会使需要移植的恶性血液病患者基本都能及时在身边找到合适供者。但与HLA相合移植比较,由于HLA不同的免疫学障碍,HEA单倍体相合移植面临植入失败率高、造血重建慢、移植物抗宿主病(GVHD)重、免疫重建延迟、致死性感染发生率高、移植相关死亡率高等诸多障碍。为了克服HLA限制就必须在临床上尽可能地建立免疫耐受,免疫耐受是指机体只对以前接触过的特定抗原不应答,而对不引起耐受的其它抗原仍能进行良好的免疫应答,免疫耐受具有的免疫特异性与免疫缺陷或药物引起的对免疫系统的普遍抑制作用相比具有显而易见的优势,如果能够成功诱导免疫耐受,HLA单倍体相合移植将会取得与全相合移植相同的临床效果,从而显著扩大移植的适应征,提高患者的存活率。所以在器官移植日益发展的今天,对免疫耐受产生的机制及人工诱导免疫耐受方法的研究受到了科学界的广泛关注,是亟待解决的医学课题。目前结合国内外文献报道,造血干细胞移植中诱导免疫耐受的方法许多仍在动物实验或临床实验研究阶段,真正用于临床还需要更多的研究和探索,本研究首先旨在临床上对单倍体相合PBSCT患者采用切实可行的方案实施免疫耐受诱导,并且从临床治疗效果、嵌合体形成、细胞因子及免疫重建等实验角度来探讨是否达到免疫耐受,并与同期进行的全相合PBSCT进行对照研究,以探讨方案的可行性。第一部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植治疗恶性血液病的临床研究目的:探讨应用亲属HLA单倍体相合allo-PBSCT治疗恶性血液病的疗效。方法:亲属供者HLA单倍体相合未去除T细胞(TCD)的allo-PBSCT治疗恶性血液病患者20例,移植后结果与同期连续完成的25例供受者HLA全相合组相比较。用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)对供者进行外周血干细胞(PBSC)动员,动员前后检测外周血及单采PBSC移植物中单个核细胞(MNC)及CD34~+细胞数。预防GVHD方案在HLA全相合移植者采用环孢素A(CsA)+氨甲喋呤(MTX)标准方案,HLA一个位点不合者在上述方案基础上加用霉酚酸酯(MMF),2～3个位点不合者在CsA+MTX+MMF方案的基础上又加用抗胸腺细胞球蛋白(ATG)及CD25单抗。结果:单倍体组和全相合组输入的MNC的中位数分别为14.62(8.59-31.78)×10~8/kg体重及14.45(7.62-19.9)×10~6/kg体重,单倍体组和全相合组输入的CD34~+细胞的中位数分别为9.13(4.57-41.78)×10~6/kg体重及6.58(2.31-18.89)×10~6/kg体重。45例患者全部植活,20例单倍体患者中位数植活时间为13(10～20)d,现中位数随访时间21(2～64)个月,无白血病存活17例(85%),25例全相合患者中位数植活时间为14(8～17)天,现中位数随访时间23(6～40)个月,无白血病存活20例(80%)。HLA全相合组及单倍体组2年预期无病生存率分别为77.2%和76.4%(P＞0.05),单倍体组的aGVHD发生率(35%)与全相合组(8%)相比无显著差异(P＞0.05),cGVHD的发生率在两组间(45%,40%)亦无显著差异(P＞0.05),MNC及CD34~+细胞数与aGVHD及cGVHD的发生率均无相关性。结论:1)在CsA+MTX标准方案的基础上依据HLA不合的差异程度适当增加免疫抑制剂可减少和减轻亲属HLA单倍体相合PBSCT中GVHD的发病率及严重性并改善生存率。2)应用亲属HLA单倍体相合PBSCT可以突破HLA障碍,显著扩大移植的适应征。第二部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植供受者嵌合体形成的动态检测目的:建立荧光标记的多重扩增短串联重复序列(STR)结合毛细管电泳定量检测allo-PBSCT供受者嵌合体的方法,并探讨嵌合体形成与免疫耐受及临床预后的关系。方法:采用PE9700扩增仪扩增15个STR位点:D8S1179、D21S11、D7S820、D3S1358、CSFIPO、THO1、D13S317、D16S539、D2S1338、D19S433、VWA、TPOX、D18S51、D5S818、FGA位点和一个性别位点Amelogenin,用3130XL型DNA测序仪对上述位点进行基因型分析,并比较供受者移植前后的基因型,确定嵌合体的形成类型,以作为异基因造血干细胞移植中的植活证据,同时用无关个体的DNA混合实验进行可行性和准确性研究。结果:用该方法分析35例移植对的结果显示:其中32例在15个STR位点中均至少有两个可以区分供受者的有信息位点(有3例无移植前受者标本),35例患者均在移植后1个月时STR位点及性别位点转为供者型,形成了完全供者嵌合体(CC),且HLA单倍体相合的15例患者也达到了100%的供者植入,部分患者于14天抽血时即转为供者型,并在随访过程中持久不变。35例患者同时进行移植后红细胞抗原、性染色体及PCR结合聚丙烯酰胺凝胶电泳检测嵌合体形成,对HLA单倍体相合患者同时进行移植后HLA分型检测,上述指标均于移植后不同时间转为供者型。扩增产物中供受者DNA含量的百分比同扩增前混合样本的比例呈显著直线相关(P＜0.01),最小检出DNA百分比为5%。结论:1)用基因分析仪对STR位点进行基因型检测具有快速、无污染和自动化高、可定量及灵敏度高等优点,用于检测allo-PBSCT植活状态是可靠的。2)本组移植患者所采用的诱导免疫耐受的方法可以成功地诱导CC的形成。第三部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植患者外周血Th1/Th2型细胞因子与GVHD的关系目的:探讨单倍体allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4水平的变化及其临床意义。方法:用流式细胞仪动态检测28例行allo-PBSCT患者外周血淋巴细胞中IFN-γ和IL-4的水平。结果:13例单倍体相合患者移植后IFN-γ的水平逐渐降低,并自+6个月开始显著低于移植前水平(P＜0.05),于+18个月时达最低值;而IL-4的水平在移植后初期呈下降趋势,在+1月至+6月时显著低于移植前水平(P＜0.05),但自+12月至+18月时显著高于移植前水平;15例全相合组患者移植后IFN-γ的水平也逐渐降低,而IL-4的水平在移植后呈上升趋势,在+18月时显著高于移植前水平。两组IFN-γ和IL-4的水平在移植后不同时间均无显著差异。所有患者均获得造血重建,其中5例发生aGVHD,8例发生cGVHD,IFN-γ在aGVHD~+组显著高于aGVHD~-组(P＜0.05),而IL-4的水平在两组间无显著差异(P＞0.05)。IFN-γ和IL-4的水平在cGVHD~+组和cGVHD~-组之间均无显著差异(P＞0.05)。结论:1)IFN-γ在人类aGVHD的发病中起重要的正向调节作用,可干扰免疫耐受的形成,移植后动态检测IFN-γ水平有助于预测aGVHD的发生。2)加强的预处理及预防GVHD方案对单倍体组IFN-γ和IL-4的表达并无显著影响。第四部分亲属HLA单倍体外周血干细胞移植后免疫功能的随防研究目的:探讨HLA单倍体相合allo-PBSCT后免疫功能重建的规律,及时指导移植后感染的防治。方法:采用间接免疫荧光法测定上述15例单倍体相合患者在接受allo-PBSCT后外周血T(CD3、CD4、CD8)、B(CD19)、NK(CD56)细胞亚群的动态变化,结果与同期连续完成的25例HLA全相合患者相比较,以32名健康供者测定的结果作为对照。结果:1)CD3~+、CD4~+、CD4~+/CD8~+在+1月时均比正常对照显著下降,CD3~+细胞在+3月时即恢复正常,CD4~+细胞在+3月时仍显著低于正常对照,在+6～+12月时基本达到正常;CD8~+细胞的恢复较快,在+1月时仅比正常对照略下降,而在+3月、+6月时已显著高于正常对照,于+12月后逐渐恢复正常;CD4~+/CD8~+在移植后逐渐下降,在+1、+3、+6月时均比正常对照显著下降,且在+3月及+6月时呈倒置现象,+12月后逐渐恢复正常;CD19~+B细胞在移植后无下降,且在移植+1月及+18月显著高于正常对照;CD56~+NK细胞在移植后也无明显下降,且在移植+3月时显著高于正常对照。2)全相合和单倍体相合组的T、B、NK细胞亚群在+1月、+6月、+12月时相比均无显著差异,但在移植+3月时,单倍体相合组的CD3~+、CD8~+细胞显著高于全相合组(P＜0.05),而CD4~+/CD8~+显著低于全相合组,且呈倒置。3)在移植后早期+1月和+3月时aGVHD~+组和aGVHD~-组的各淋巴细胞亚群均无显著差异(P＞0.05);在移植后+1月时cGVHD~+组的CD4~+细胞显著高于cGVHD~-组(P＜0.05),其它时间段两组各淋巴细胞亚群均无显著差异(P＞0.05)。结论:1)多种免疫抑制剂的联合应用对HLA单倍体未进行TCD的allo-PBSCT免疫重建的速度无显著影响,值得推广应用。2)aGVHD和cGVHD的发生对allo-PBSCT免疫重建无重大影响。