嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）是一种人-畜-鱼共患的革兰阴性致病菌。其分布和感染宿主范围广,引发的运动性气单胞菌败血症（MAS）对淡水养殖业造成严重危害。已知Ⅵ型分泌系统（T6SS）在该菌的致病性和环境适应性上发挥重要作用。前期研究鉴定嗜水气单胞菌NJ-35菌株中编码1套T6SS。本研究利用基因缺失技术、细菌竞争试验和蛋白pull down技术分析嗜水气单胞菌T6SS假定效应蛋白基因生物学功能,鉴定效应分子,分析其功能和分泌机制,旨在进一步阐明T6SS的致病机制。1 嗜水气单胞菌T6SS假定效应蛋白基因tle1AH1和tle1AH2生物学功能分析为鉴定和研究嗜水气单胞菌NJ-35的T6SS新型效应蛋白及其功能,进一步阐明T6SS的作用机制,基于已知的保守结构域DUF4123,对NJ-35株全基因组序列进行潜在的T6SS效应蛋白基因预测,用同源重组方法构建基因缺失突变株和相应互补株。对野生株、缺失株和互补株分别进行细菌竞争试验,并测定细菌生长曲线、运动性、生物被膜形成能力、抗巨噬细胞吞噬能力及其对斑马鱼的半数致死量（LD50）等。成功预测到2个可能的效应蛋白基因tle1AH1（U87617550）和tle1AH2（U87617730）,并构建tle1AH1和tle1AH2基因缺失株和相应互补株。生物学特性分析发现,与野生株比较,两个缺失株对大肠杆菌和副溶血弧菌生长的抑制能力显著降低,对同属内其他气单胞菌种类或嗜水气单胞菌种内其他菌株生长无抑制作用;对斑马鱼的LD50分别增加11和17倍;在生物被膜的测定上,tle1AH1缺失株形成能力增强,而tle1AH2缺失株的能力减弱;tle1AH1缺失株抗吞噬能力明显下降,而tle1AH2缺失株则无明显变化;互补株各项特性测定均达到野生株程度。研究表明,鉴定到嗜水气单胞菌两个假定T6SS效应蛋白基因,为进一步探讨T6SS在该菌致病过程中的作用奠定基础。2 嗜水气单胞菌T6SS效应-免疫蛋白对Tle1-Tli1Tli2AH2的鉴定为验证嗜水气单胞菌假定效应蛋白Tle1AH1和Tle1AH2的功能及对应的同源免疫蛋白,进一步阐明T6SS毒力机制,采用同源重组方法构建效应-免疫基因的缺失株和对应同源免疫基因互补株,通过细菌竞争试验验证免疫蛋白保护作用。结果显示,在tle1-tli1AH1缺失株中互补tli1AH1未观察到免疫保护作用;在tle1-tli1tli2AH2缺失株中互补单个的tli1AH2或者tli2AH2也不能起到免疫保护作用,但是同时互补tli1tli2AH2能在野生株杀伤过程中起到免疫保护作用。进一步通过蛋白分泌试验发现Tle1AH2是通过T6SS分泌,具有磷脂酶催化活性位点GxSxG,其核心催化位点是丝氨酸。鲫鱼体内定殖试验表明,野生株与tle1AH2缺失突变株共感染鲫鱼后,肝胰脏、脾脏和肾脏中的野生株细菌载量均显著高于缺失株,有明显的竞争优势。以上结果分析表明,Tle1-Tli1Tli2AH2是嗜水气单胞菌T6SS的效应-免疫蛋白对,在细菌体内定殖过程中发挥重要作用。3 嗜水气单胞菌T6SS效应蛋白Tle1AH2的分泌方式研究为了验证嗜水气单胞菌的效应蛋白Tle1AH2的在分泌过程中是否与其他蛋白的相互作用,构建Tle1AH2、Hcp、VgrG蛋白的不同原核表达载体,诱导表达并纯化蛋白,采用GST pull down试验分析蛋白之间的相互作用。结果表明,各蛋白分子大小符合预期,纯化后Western blot验证无误,pulldown结果显示Tle1AH2可以和VgrG发生结合,但不能和Hcp结合,说明Tle1AH2的分泌过程依赖于VgrG蛋白。综上,本研究分析了假定效应蛋白基因的生物学功能,成功鉴定嗜水气单胞菌T6SS的效应-免疫蛋白对Tle1-Tli1TliAH2,并明确了效应蛋白Tle1通过T6SS分泌的方式,为进一步阐明嗜水气单胞菌的致病机制提供理论基础。