目的:杂色曲霉素（sterigmatocystin, ST）是由杂色曲霉、构巢曲霉等曲霉菌属真菌所产生的一种真菌毒素,广泛存在于自然界,是人类食品和动物饲料中最常见的污染物之一。ST具有致癌性,可诱发多种组织癌变。本实验室前期研究发现,ST可诱导体外培养的人胚胃黏膜细胞发生恶性转化,并且可以诱导体外培养人胃黏膜上皮细胞GES-1发生G₂期阻滞。进一步研究还发现,ST处理可以引起GES-1细胞发生DNA损伤。上述研究初步揭示了杂色曲霉素对人胃粘膜的可能致癌作用。当细胞遭受药物等各种因素刺激发生DNA损伤后, ATM-Chk2信号通路快速激活,通过抑制酪氨酸磷酸酶Cdc25C进而抑制Cdc2-CyclinB1复合物的活性从而使细胞发生G₂期阻滞。已证实在赭曲霉毒素A（Ochratoxin A, OTA）诱导的GES-1细胞G₂期阻滞中,ATM-Chk2信号通路的激活及其所诱导的Cdc25C、Cdc2、CyclinB1表达变化发挥了重要作用。而在ST诱导的GES-1细胞G₂期阻滞中,ATM-Chk2信号通路是否发挥作用却未见报道。有鉴于此,在前期工作的基础上,我们采用蛋白免疫印迹和免疫共沉淀技术,检测不同剂量、不同时间ST处理对GES-1细胞ATM-Chk2信号通路和G₂期阻滞相关因子的影响,分析两者的相互关系,以期揭示ATM-Chk2信号通路对杂色曲霉素诱导人胃黏膜上皮细胞G₂期阻滞的相关因子的可能影响。方法:1选择对数生长期的细胞随机分为溶剂对照组、0.075μM、0.3μM、1.5μM、3μM和6μM ST处理组,继续培养48h收集细胞进行相关指标检测。另选择对数生长期的细胞随机分为正常对照组、12h、24h、48h、72h和96h ST处理组,各ST处理组的剂量均为3μM,继续培养分别于相应时间收集细胞。2采用蛋白免疫印迹技术,分别检测不同浓度、不同时间ST处理后,细胞ATM/p-ATM、Chk2/p-Chk2、Cdc25C/p-Cdc25C、Cdc2/p-Cdc2以及CyclinB1的表达水平的变化。3采用免疫共沉淀技术检测ST处理对细胞Cdc2-CyclinB1复合物的影响。结果:1 ST对GES-1细胞ATM-Chk2信号通路的影响Western Blot结果显示,与溶剂对照组相比,0.075μM、0.3μM、1.5μM、3μM和6μM ST处理组ATM/p-ATM的表达水平均明显升高（P<0.05）,并且p-ATM水平与ST的处理剂量成正相关（r=0.908,P<0.01）。同时发现,不同剂量ST处理均可明显上调Chk2/p-Chk2的水平（P<0.05）,在0.075μM～6μM的剂量范围内,p-Chk2的水平与ST的剂量成正相关（r=0.826, P<0.01）。与正常对照组相比,ST处理24h、48h、72h以及96h后GES-1细胞ATM/p-ATM的表达水平均明显升高（P<0.05）,并且p-ATM水平与ST的处理时间成正相关（r=0.826,P<0.01）。同时Chk2/p-Chk2的表达水平也明显升高（P<0.05）,在24h～96h时间范围内,p-Chk2水平与ST的处理时间成正相关（r=0.675,P<0.01）。综上结果表明,在上述剂量和处理时间内,ST可以剂量、时间依赖性地引起ATM-Chk2信号通路的激活。2 ST对GES-1细胞G₂期阻滞相关因子的影响Western Blot结果表明,与溶剂对照组相比,0.3μM、1.5μM、3μM和6μM ST处理组GES-1细胞Cdc25C的表达水平明显降低（P<0.05）,而1.5μM～6μM ST处理组p-Cdc25C显著升高（P<0.05）。各ST处理组Cdc2的表达水平也明显降低（P<0.05）,并且在0.075μM～6μM的剂量范围内,Cdc2水平与ST的剂量成负相关（r=-0.933,P<0.01）,而1.5μM～6μM ST处理可以升高p-Cdc2（P<0.05）。与此同时,较高剂量ST处理组（3μM和6μM ST处理组）CyclinB1的表达水平明显增高（P<0.05）。免疫共沉淀结果表明,与溶剂对照组相比,0.075μM～6μM ST处理可以明显减少Cdc2-CyclinB1复合物的形成（P<0.05）,复合物中Cdc2的表达水平与ST的剂量成负相关（r=-0.977,P<0.01）。与正常对照组相比,12h、24h、48h、72h、96h ST处理组Cdc25C的蛋白表达水平明显降低（P<0.05）,而24h～96h ST处理组p-Cdc25C明显升高（P<0.05）。同时,12h～96h ST处理组Cdc2的表达水平显著降低,并且在此时间范围内Cdc2的水平与ST处理时间成负相关（r=-0.889,P<0.01）,而经24h～96h ST处理后p-Cdc2的水平明显升高（P<0.05）。此外,CyclinB1在48h、72h、96h组的表达水平也明显高于正常对照组（P<0.05）。以上结果提示,ST处理可以显著影响G₂期阻滞相关因子的表达,主要表现在:Cdc25C和Cdc2表达降低,p-Cdc25C、p-Cdc2、CyclinB1表达升高,同时还可以剂量依赖性地减少Cdc2-CyclinB1复合物的形成。3 ST对ATM-Chk2信号通路和G₂期阻滞相关因子影响的相关性分析不同剂量ST处理后, p-ATM的水平与p-Chk2成正相关（r=0.675,P<0.01）,与Cdc2成负相关（r=-0.983,P<0.01）,与Cdc2-CyclinB1复合物的水平成负相关（r=-0.969,P<0.01）。不同处理时间实验中,p-ATM的水平与p-Chk2成正相关（r=0.885,P<0.01）,Cdc2成负相关（r=-0.921, P<0.01）。可见,随着p-ATM的升高,p-Chk2也随之上升,而Cdc2和Cdc2-CyclinB1复合物的水平是随之下降的。由此我们认为,p-ATM活化了其下游的p-Chk2,继而ATM-Chk2这条信号通路影响了G₂期阻滞的相关因子的表达。结论:1 ST可以剂量、时间依赖性的激活ATM-Chk2信号通路,与此同时,降低G₂期阻滞的相关因子Cdc25C和Cdc2的蛋白表达水平,升高p-Cdc25C, p-Cdc2,CyclinB1的水平,剂量依赖性的降低Cdc2-CyclinB1复合物的形成。2 ST激活ATM-Chk2信号通路可能是其诱导GES-1细胞发生G₂期阻滞的分子机制之一。