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目的 类风湿关节炎(Rheumatoid Arthritis,RA)是一种以慢性、侵袭性关节滑膜炎为主要特征的系统性自身免疫性疾病,多种促炎细胞因子表达增加,参与RA的发病机制,其中TNF-α可诱发和维持受累关节滑膜的炎症,是RA致病中最关键的细胞因子。此外,本课题组前期报道钙网织蛋白(Calreticulin,CRT)可能参与了RA的发病进程,CRT在RA患者体内表达升高,且血清CRT水平与RA患者疾病活动度呈显著正相关。核苷酸结合寡聚化结构域样受体3(nucleotide binding oligomerization domain-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)炎症小体是一种触发炎症的大分子复合物,能识别多种病原相关分子模式(PAMP)和损伤相关分子模式(DAMP),引起白细胞介素的分泌,已有研究表明,在RA患者外周血单核细胞中,NLRP3炎症小体活化产物胱天蛋白酶1(Caspase-1)和IL-1β、IL-18明显升高。目前NLRP3炎症小体活化的分子机制尚未完全阐明。本课题拟探究TNF-α/CRT双信号对RA成纤维样滑膜细胞和内皮细胞中NLRP3炎症小体的活化作用及其调控分子机制,为揭示RA的炎症机制和寻找新的治疗靶点奠定实验基础。方法 1.收集天津医院关节外科中心行关节镜及膝关节置换术患者的滑膜组织标本进行实验研究,其中RA患者12例,OA患者10例。采用免疫组织荧光法观察分析NLRP3分子和ASC分子在RA及OA滑膜中的表达和定位。2.体外分离培养RA患者滑膜组织中的成纤维样滑膜细胞(FLS)(胶原酶消化法)和原代脐静脉内皮细胞(HUVECs)。采用免疫印迹法(Western Blot)检测细胞裂解液中NLRP3,pro-IL-1β和pro-IL-18的表达,细胞培养上清中Caspase-1 p20的表达,以及RA和OA滑膜组织中Hu R分子的表达。3.实时荧光定量PCR检测RA FLS和HUVECs中NLRP3,pro-IL-1β和pro-IL-18的m RNA水平。4.酶联免疫吸附试验(ELISA)检测RA FLS和HUVECs细胞培养上清中IL-1β和IL-18的表达水平。5.采用免疫组织化学染色法(IHC)检测Hu R分子在RA及OA滑膜中的表达。6.采用细胞免疫荧光法(ICC)分析RA FLS和HUVECs中Hu R分子的表达和定位。7.采用小干扰RNA介导的基因沉默技术下调RA FLS中Hu R的表达。结果 1.间接免疫荧光结果显示,NLRP3和ASC分子在RA滑膜组织中的表达(0.095±0.005;0.076±0.003)高于OA(0.075±0.002,t=3.450,p=0.003;0.060±0.004,t=3.544,p=0.002)。在RA滑膜中的FLS和血管内皮细胞中均观察到NLRP3、ASC和cleaved-IL-1β的表达。2.Western Blot结果显示,TNF-α上调RA FLS和HUVEC中NLRP3和pro-IL-1β的蛋白表达,pro-IL-18在HUVEC中的表达也增加,但在RA FLS中没有变化。q RT-PCR结果显示,在TNF-α刺激的RA FLS中,与对照组相比(0.687±0.148;0.727±0.119),NLRP3和pro-IL-1β的m RNA表达显著增加(3.123±0.263,p<0.05;3.697±0.142,p<0.001),但pro-IL-18的表达没有明显差异(0.430±0.079,0.390±0.137,p>0.05);在TNF-α刺激的HUVEC中,与对照组相比(0.707±0.148,0.0833±0.023,0.303±0.160),三者的m RNA表达均显著增加(1.920±0.271,p<0.05;0.993±0.153,p<0.001;1.107±0.222,p<0.01)。3.Western Blot结果显示,TNF-α/CRT双信号刺激促进RA FLS和HUVEC中Caspase-1 p20的产生。同时与对照组相比,TNF-α/CRT组引起RA FLS[(222.9±25.66)pg/ml;(502.3±28.40)pg/ml,p<0.05]和HUVEC[(221.8±14.47)pg/ml,335.9±25.87,p<0.05]分泌型IL-1β的显著增加,分泌型IL-18在HUVEC培养上清中也显著升高[(37.91±11.17)pg/ml,(246.3±37.21)pg/ml,p<0.05],但在RA FLS中没有显著差异[(36.13±10.71)pg/ml,(55.87±9.468)pg/ml,p>0.05]。4.免疫组化(0.190±0.009,0.023±0.002,t=18.14,p<0.0001)、Western Blot和q RT-PCR(4.397±0.255,1.463±0.119,t=10.43,p=0.0005)结果显示,Hu R在RA滑膜组织中的蛋白和m RNA表达显著高于OA。5.Western Blot和细胞免疫荧光结果显示,TNF-α不能引起RA FLS和HUVEC中Hu R蛋白表达的改变,但能够引起Hu R在FLS和HUVEC中的核质易位。6.Hu R降表达导致TNF-α预孵育的RA FLS中NLRP3蛋白表达减少,m RNA稳定性下降,并进一步引起在TNF-α/CRT刺激下的Caspase-1 p20蛋白减少,IL-1β的分泌减少,但对IL-18没有影响。结论1.TNF-α/CRT双信号能够诱导RA FLS和HUVECs中NLRP3炎症小体的活化。2.Hu R的核浆穿梭可能介导了RA FLS中NLRP3分子的蛋白表达和m RNA稳定性的上调,进而促进TNF-α/CRT双信号介导的NLRP3炎症小体活化。