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研究目的:研究胆道闭锁(BA)患儿及小鼠模型中ROR-γt基因乙酰化水平表达及作用;探索TNFα-TNFRs信号调控ROR-γt基因乙酰化水平的分子机制,并通过动物干预实验注射TNFR1和TNFR2抗体,验证TNFα-TNFR2通过调控ROR-γt基因表达,促进Th17细胞分化、介导胆管炎性损伤。研究方法:2016年10月至2018年12月期间,59例就诊于华中科技大学同济医学院附属协和医院小儿外科的胆道闭锁患儿,于行肝门空肠吻合术(Kasai术)时留取肝脏组织;同期收取42例胆总管囊肿患儿肝脏组织作为对照组。新生Balb/c小鼠注射轮状病毒(Rhesus Rotavirus,RRV)建立胆道闭锁动物模型。将新生小鼠随机分为四组:(1)RRV组:小鼠出生后于12小时内腹腔注射20μL 1×105pfu RRV建立胆道闭锁模型;(2)对照组:新生小鼠出生后12小时内腹腔注射等量生理盐水作为对照;(3)TNFR1干预组:新生小鼠出生后12小时内腹腔注射20μL 1×105pfu RRV,其后每天注射TNFR1抗体(10μg/只)直至出生后7天;(4)TNFR2干预组:新生小鼠出生后12小时内腹腔注射20μL 1×105 pfu RRV,其后每天注射TNFR2抗体(10μg/只)直至出生后7天;(5)TNFα干预组:新生小鼠出生后12小时内腹腔注射20μL1×105 pfu RRV,其后每天注射TNFα抗体直至出生后7天。第一部分:取BA患儿和对照组肝脏组织,通过RT-q PCR、western blot测定、比较两组ROR-γt表达水平;并利用染色质免疫沉淀(chromatin immunoprecipitation,Ch IP)检测法检测两组中ROR-γt基因启动子区乙酰化水平。分别留取小鼠RRV组和对照组第3天、第7天和第14天肝脏组织,检测两组ROR-γt表达水平;流式细胞术测定两组Th17细胞数量及比例,酶联免疫吸附试验(ELISA)检测Th17细胞相关细胞因子表达水平;Ch IP法检测比较两组小鼠ROR-γt基因启动子区乙酰化水平。第二部分:取BA患儿及对照组肝脏组织,以及小鼠RRV组和对照组第3天、第7天和第14天肝脏组织,利用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测两组肝脏组织中TNFα表达水平;免疫组织化学染色法检测肝脏组织中TNFR1和TNFR2的表达情况;通过RT-q PCR、western blot测定、比较两组p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表达水平。第三部分:观察小鼠RRV组、对照组、TNFR1、TNFR2和TNFα干预组五组小鼠体重变化、生存率、胆道闭锁表型和肝脏组织病理情况;分别留取各组小鼠第3天、第7天和第14天肝脏组织,RT-q PCR和Western blot等方法检测各组ROR-γt表达水平以及p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表达水平;Ch IP法检测比较各组小鼠ROR-γt基因启动子区乙酰化水平;流式细胞术测定各组Th17细胞数量及比例。实验结果:第一部分:BA患儿和小鼠模型较之于相应对照组比较,ROR-γt基因启动子区乙酰化水平显著升高(p<0.001),ROR-γt表达量明显升高(p<0.01),Th17细胞分化增多,IL-17A分泌增多(p<0.001);且BA小鼠模型中,ROR-γt基因启动子区乙酰化水平和蛋白表达量随时间增长,于第7天达到峰值,与Th17细胞增殖和相关细胞因子上调趋势一致。第二部分:BA患儿肝脏组织中TNFα表达较对照组未见明显升高,但免疫组织化学染色显示TNFR1和TNFR2表达均增多,TNFR2表达显著上调(p<0.01),肝脏组织汇管区局部大量炎性细胞浸润;小鼠RRV组较对照组相比,各个时间点TNFα表达均显著升高(p<0.05),TNFR1和TNFR2表达也均增多,且TNFR2增多更为显著(p<0.01),肝脏组织汇管区大量炎性细胞浸润。BA患儿和小鼠RRV组肝脏组织中p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65表达较相应对照组均显著升高(p<0.01)。第三部分:TNFRs干预组小鼠与RRV组相比,均有不同程度的胆道闭锁发生率降低、表型减轻,生存率提高,且与TNFR1干预组比较,TNFR2和TNFα干预组治疗效果更显著;此外,TNFR2和TNFα干预组中,p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表达水平较RRV组显著下降(p<0.01),且ROR-γt蛋白表达和基因启动子区乙酰化水平较RRV组也明显下降(p<0.001),Th17细胞比例减少(p<0.001);而TNFR1干预组中p38、JNK,STAT3和c-Rel,p65的表达和ROR-γt基因乙酰化水平与RRV组未见明显差别。实验结论:1.BA患儿及小鼠模型肝脏组织中,ROR-γt基因启动子区乙酰化水平显著升高,ROR-γt表达增高,Th17细胞分化、增殖增多,IL-17A分泌显著增多;2.BA患儿及小鼠模型肝脏组织中,TNFα-TNFRs表达升高,上调下游NF-κB和MAPK-STAT3分子通路,促进ROR-γt基因乙酰化水平增高;3.阻断TNFα-TNFR2信号后,下游NF-κB和MAPK-STAT3表达显著减少,ROR-γt基因启动子区乙酰化水平降低,Th17细胞表达减少,小鼠胆道闭锁发生率降低、表型减轻,生存率提高。