人胚肺成纤维细胞端粒DNA损伤对端粒缩短的贡献研究

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端粒是位于几乎所有真核细胞染色体末端的由DNA简单重复序列及其结合蛋白构成的复杂结构。端粒DNA和其结合蛋白有着防止非正常的重组和修复,保持一个稳定的线状染色体末端的作用。目前认为真核细胞的分裂增殖潜力由细胞的端粒长度控制,随着细胞的分裂,端粒DNA逐渐丢失。当端粒因分裂而缩短至临界长度时,细胞的内在机制发生作用使细胞停止分裂。除因DNA半保留复制机制不能完全复制线状DNA的末端已被证明是端粒缩短的原因之一外,端粒DNA损伤产生的单链及双链断裂在下一代细胞分裂中的丢失也会造成端粒的缩短。 目前还没有一种可靠的方法检测发生在端粒DNA上的因损伤造成的链断裂。根据单细胞凝胶电泳的原理,我们建立了一种方法检测细胞端粒因DNA链断裂而产生的端粒碎片。以人胚肺成纤维细胞MRC-5为材料,在碱性条件下原位裂解包埋于琼脂糖块中的细胞,通过电泳将端粒碎片与染色体DNA分离,并由端粒特异性的探针通过southern杂交检测端粒DNA碎片量。结果表明经9.1到291μMH2O2处理的MRC-5细胞发生的端粒DNA碎片量随H2O2浓度增加成梯度的显著增加;不同数量的MRC-5细胞在291μH2O2和0.1mM Fe2+共同作用下产生的端粒DNA碎片量和其细胞数量间同样符合线性关系。表明此方法应用于检测端粒DNA链断裂碎片的可行性。 用电泳分离MRC-5细胞在静息培养1天及3周后端粒DNA因链断裂产生的端粒碎片,发现它们分别占端粒DNA总核苷酸数量的0.31±0.22%和0.34±0.29%。根据计算机模拟,上述数据分别对应于0.58±0.41个断裂/细胞和0.63±0.55个断裂/细胞:两者的断裂数目没有显著变化。根据端粒缩短的模型和MRC-5细胞的端粒长度,它们将在细胞分裂过程中导致约22bp的端粒缩短,占在MRC-5细胞中观察到的约50-100 bp/世代的缩短速率的小部分。这一结果表明端粒区DNA链断裂在正常生理条件下不是端粒丢失的主要因素。
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