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慢性乙型病毒性肝炎(Chronic Hepatitis B,CHB)的发病机制一直是传染病领域研究的重点、难点。至今,乙型肝炎病毒(Hepatitis B Virus,HBV)感染慢性化及其持续感染的机制尚未阐明。在当前慢性乙型肝炎治疗缺乏有效措施的情形下,研究阐释HBV感染慢性化及持续感染的发生机制尤显重要、紧迫。很多患者在HBV急性感染后不能彻底清除病毒而导致HBV感染的持续,最终成为CHB患者。目前,CHB是全球性的公共卫生问题,全世界范围内有3.5亿HBV携带者,相当大的一部分患者发展为严重的并发症,如肝硬化、肝细胞肝癌等。虽然对于一个患者为何发展成为慢性携带、HBV持续感染状态的确切机制还不明了,但是可以肯定的是,宿主免疫反应的缺陷在这一病理过程的形成中起了至关重要的作用。机体的抗病毒感染免疫包括天然免疫和适应性免疫两大部分,而作为重要天然免疫细胞的树突状细胞(Dendritic Cells,DCs),是目前所知功能最强的抗原提呈细胞(Antigen Presenting Cells,APCs),广泛分布于淋巴组织和非淋巴组织,捕获、提呈抗原(Antigen,Ag)给T淋巴细胞,启动特异性免疫应答,因而在连接天然免疫和适应性免疫应答中起了重要的桥梁作用。较普遍的观点是在HBV持续感染中存在DCs的功能障碍、成熟障碍,不能激活初始T淋巴细胞(Na(i|¨)ve T Lymphocyte),进而不能启动特异性免疫应答(尤其是针对HBV的特异性的细胞免疫应答),而不能清除肝细胞中的HBV,最终导致了HBV的持续感染,故而认为DCs功能障碍、成熟障碍在HBV持续感染时起了关键性的作用。但目前对DCs功能障碍、成熟障碍的确切机制不甚明了。而DCs的成熟有赖于病原体源性信号、T细胞源性信号和炎性环境三者的共同作用。而干扰素(Interferon,IFN)作为炎性环境中很重要的因素,在DCs的成熟诱导过程中至关重要。如同DCs功能的发挥有赖于Toll样受体(Toll-like Receptors,TLRs)的激活和信号转导一样,作为诱导DCs成熟重要因素的IFN即是经由TLR3的激活及下游的信号转导产生的。而我们的前期研究发现TLR3在CHB患者中表达下调,鉴于TLR3的激活在诱生IFN(IFN为DCs产生,同时又可作用于DCs,对后者的成熟和功能具有重要的作用,在HBV的抗感染免疫中非常重要)、以及IFN对DCs成熟的诱导作用。我们设想,是否由于TLR3的表达下调,使得IFN的表达下调,进而影响了DCs的成熟,导致了DCs的成熟障碍。为验证这一假设,本研究检测了CHB患者外周血DCs TLR3触发后Ⅰ型IFN表达分泌情况,以期评价慢性乙型病毒性肝炎患者外周血树突状细胞的功能状态,探讨其在病毒持续感染及肝炎慢性化机制中的可能作用。目的检测慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞来源的树突状细胞TLR3触发后Ⅰ型干扰素的表达分泌情况,评价慢性乙型肝炎患者单核细胞来源的树突状细胞的功能状态,探讨其在病毒持续感染、肝炎慢性化机制中的作用。方法筛选慢性乙型肝炎患者(CHB组)26例,其外周血用Ficoll密度梯度离心法分离外周血单个核细胞,再经免疫磁珠细胞分选法获得纯化的单核细胞,体外诱导培养为树突状细胞,给予不同浓度的纯化HBV相关抗原(HBsAg、HBeAg、HBcAg)及聚肌胞苷酸(Poly I:C)刺激,在刺激0h,1h,3h,8h,16h,24h,48h收集细胞培养上清液,同时收集、处理DCs。用酶联免疫吸附试验法(ELISA法)测定血浆及细胞培养上清液中Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)蛋白表达水平,用实时荧光定量PCR法(Real-time PCR法)检测Ⅰ型干扰素(IFN-β)的mRNA水平。并用CCK8法检测部分研究对象的DCs功能。同时以18例健康人(Control组)作对照。结果1人CD14磁珠阳性分选出的CD14~+单核细胞纯度＞95%,能满足体外大量获取DCs,进行后续DCs实验的要求。2不同浓度的纯化HBV相关抗原(HBsAg、HBeAg、HBcAg)刺激后,IFN水平在两组间的差异不具有统计学意义。3血浆中IFN-α/β在Control组(18例)(80.98±28.30,115.90±29.14)pg/ml和CHB组(26例)(71.11±10.27,120.53±26.03)pg/ml,各亚型在两组间的差异均无统计学意义。4刺激0h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(83.69±15.90,76.09±18.06)pg/ml,差异不具有统计学意义:CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(37.65±6.24,40.54±8.84)pg/ml,差异不具有统计学意义。5刺激1h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(82.21±19.74,78.10±13.87)pg/ml,差异不具有统计学意义;CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(37.76±6.60,40.43±8.43)pg/ml,差异不具有统计学意义。6刺激3h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(83.99±16.05,78.89±12.68)pg/ml,差异不具有统计学意义;CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(37.80±8.75,40.97±12.81)pg/ml,差异不具有统计学意义。7刺激8h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(86.62±13.34,80.22±16.92)pg/ml,差异不具有统计学意义;CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(38.02±7.52,49.16±10.42)pg/ml,差异具有统计学意义(t=-4.124,P＜0.05)。8刺激16h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(86.21±14.64,78.71±11.50)pg/ml,差异不具有统计学意义;CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(58.12±6.58,132.37±51.31)pg/ml,差异具有统计学意义(t=-7.330,P＜0.05)。9刺激24h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(85.30±16.19,79.02±13.61)pg/ml,差异不具有统计学意义;CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(34.24±6.74,48.85±19.42)pg/ml,差异具有统计学意义(t=-3.555,P＜0.05)。10刺激48h,CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-α(88.99±28.50,80.54±16.72)pg/ml,差异不具有统计学意义:CHB组(26例)和Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-β(31.20±6.71,35.04±6.16)pg/ml,差异不具有统计学意义。11刺激前后,CHB组(26例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-βmRNA分别为(3.20±0.77,4.24±0.57),差异不具有统计学意义。Control组(18例)单核细胞来源的树突状细胞表达的IFN-βmRNA分别为(0.89±0.27,5.53±1.40),差异具有统计学意义(t=-3.252,P＜0.05)。12在培养6天后(第7天),慢乙肝患者刺激同种异体淋巴细胞增殖能力,在DCs/淋巴细胞三个不同比例(1:40,1:20,1:10)时的刺激指数均低于正常对照组(P＜0.01),而在1:80时,CHB组和Control组的刺激指数无统计学差异;在1:40时,CHB组和Control组的刺激指数分别为(1.08±0.07,1.97±0.32),差异具有统计学意义(t=8.6476,P＜0.01);在1:20时,两组的刺激指数分别为(1.04±0.07,2.67±0.08),差异具有统计学意义(t=42.8129,P＜0.01);在1:10时,CHB组和Control组的刺激指数分别为(1.05±0.09,3.05±0.02),差异具有统计学意义(t=52.9503,P＜0.01)。结论1慢乙肝患者外周血DCs在乙肝病毒相关的抗原刺激下表达分泌Ⅰ型干扰素的水平较正常人表达分泌量为少,但差异无统计学意义。2 PolyI:C刺激树突状细胞表达分泌Ⅰ型干扰素的量较乙肝病毒相关抗原刺激后产生的量为多,两者有显著性差异。3 TLR3触发后单核细胞来源的树突状细胞分泌的Ⅰ型干扰素以IFN-β为主。4慢性乙型肝炎患者外周血DCs刺激T细胞功能下调,DCs存在功能障碍。5慢性乙型病毒性肝炎患者外周血单核细胞来源的树突状细胞不能正常表达分泌Ⅰ型干扰素,可能参与了DCs成熟障碍、功能障碍的形成,进而参与了HBV持续感染、肝炎慢性化的发生。