胚胎干细胞(ESC)具有多向分化潜能,其中向生殖细胞分化的能力使得其备受关注,对ESC进行转基因修饰可以使其分化为生殖细胞。DAZL基因在生殖细胞发育早期至配子产生的过程中持续表达,是调控生殖细胞发育与分化的关键基因,但其对生殖细胞发育的作用机制及其对其他与生殖相关的基因调控作用尚不明确。本研究成功克隆鸡DAZL基因,通过体外暂态表达进行亚细胞定位,建立鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系以导入外源DAZL基因,诱导cESC向生殖细胞分化,为研究DAZL基因的调控机制和胚胎干细胞来源的生殖细胞进行临床治疗的应用提供参考。主要研究内容如下：1.鸡DAZL基因的克隆、序列分析及生物信息学分析。利用巢式PCR扩增出DAZL基因的CDS区,并将其克隆至pMD19-T载体中。酶切及测序结果均表明pMD19-T-DAZL构建正确,与公布的鸡DAZL基因CDS区同源性达99%,编码氨基酸完全一致。说明克隆的DAZL基因正确无误,可以用于后续研究。2.重组表达载体构建及DAZL蛋白亚细胞定位的研究。分别构建真核表达载体DAZL-pEGFP-N1和pcDNA-DAZL,采用LipofectaminTM LTX介导重组表达载体pEGFP-C1-DAZL转染鸡胚胎成纤维细胞(CEF),48h后于荧光倒置显微镜下观察转染有DAZL-pEGFP-N1的细胞,并利用RT-PCR和Western Blot进一步鉴定Dazl-eGFP mRNA和蛋白水平的表达情况；转染有pcDNA-DAZL的实验组采用间接免疫荧光(IFA)鉴定DAZL蛋白在CEF中的表达部位。结果显示,RT-PCR、Western Blot均能检测到融合蛋白的表达,荧光显微镜观察DaZl-eGFP融合蛋白主要分布于细胞核,IFA检测结果也显示DAZL蛋白位于细胞核,与生物信息学软件预测结果相一致。3.鸡胚胎干细胞无饲养层培养体系的建立。采用药匙法从新鲜受精蛋中分离获取cESC,并通过补充外源细胞因子以无饲养层法进行培养,待其形成大克隆后,用口吸管剥离法挑取cESC克隆,用胶原酶IV-胰酶两步消化法进行cESC传代,并采用生化和免疫学方法鉴定其干细胞活性。结果表明无饲养层培养体系体外培养cES细胞能稳定传代至第6代,鉴定结果显示碱性磷酸酶(AKP)阳性和阶段特异性胚胎抗原1(SSEA-1)阳性,指明克隆能保持未分化状态,可以用于后续的诱导分化实验。4. DAZL诱导鸡胚胎干细胞分化为生殖干细胞的研究。设计质粒量800ng、900ng、1000ng三个水平,质粒、脂质体比1：1.5、1：2、1：2.5三个体系转染cESC,通过二因素比较优化LipofactiminTM LTX介导法转染体系。重组载体pcDNA-DAZL体外转染cESC,G418筛选获得阳性克隆,间接免疫荧光检测DAZL蛋白的表达,然后更换培养基进行分化培养,实时荧光定量PCR (qRT-PCR)检测相关基因表达量,IFA检测诱导细胞相关标记。结果显示质粒900ng、质脂比为1：2时,可获得最佳转染效率；过表达DAZL基因会抑制Nanog表达,诱导Stra8、C-kit、integrina6、integrinβ1等生殖细胞标记基因的表达；且免疫细胞化学检测结果显示诱导后细胞为C-kit、integrina6、integrinβ1阳性,表明诱导所产生的细胞表达生殖细胞标记性基因,为胚胎干细胞向生殖细胞方向的诱导提供基础。