眼球外壁的前1/6透明圆盘状结构为角膜，主要起到保护眼球和作为屈光介质的作用。角膜从前向后分为5层：上皮层、前弹力层、基质层、后弹力层和内皮层，其中，内皮层由单层扁平或低立方内皮细胞构成，通过其Na+-K+ATP酶的“泵”功能维持角膜的“脱水状态”。成年角膜内皮细胞不能再生，细胞受损后由邻近细胞扩大、移行填补。当细胞密度下降到其临界值（700个/mm）时，角膜功能失代偿、角膜水肿浑浊，严重时致盲即为角膜内皮盲。目前，全世界有1100万角膜内皮盲患者，而临床唯一有效的角膜内皮盲治疗手段是穿透性角膜移植术，即角膜移植。但异体角膜移植存在着免疫排斥反应和供体缺乏等限制因素。因此，研究者们致力于组织工程角膜内皮的构建。目前，常用的种子细胞包括：角膜内皮细胞、胚胎干细胞、成体干细胞和具有干细胞性质的成体细胞；常用的生物材料支架包括异体或异种角膜或角膜板层、天然或合成高分子材料。本实验旨在通过以壳聚糖基水凝胶为支架、以体外培养的兔角膜内皮细胞为种子细胞构建组织工程角膜内皮并对兔角膜内皮损伤模型进行组织工程修复，为角膜内皮盲的治疗提供依据。本实验主要进行了以下几方面工作：（1）壳聚糖基水凝胶的毒性研究：对大鼠长期腹腔注射壳聚糖基水凝胶，通过监测大鼠一般临床状况，测定肝脏、肾脏、脾脏相关血清生化指标、脏器系数，观察病理切片等手段，评价该水凝胶对大鼠主要脏器的亚慢性毒性；以壳聚糖基水凝胶浸提液培养兔角膜内皮细胞，评价该水凝胶对兔角膜内皮细胞的毒性。（2）兔角膜内皮细胞培养基的优化：以含有几种壳聚糖衍生物的条件培养基培养兔角膜内皮细胞，通过定性观察和定量评价，筛选出能够在一定浓度下对兔角膜内皮细胞的生长具有显著促进作用，且对细胞形态无明显影响的糖类，以此优化培养基。（3）兔角膜内皮损伤模型的组织工程修复：通过揭除兔角膜后弹力层和内皮层的方式构建稳定、长久的兔角膜内皮损伤模型；以壳聚糖基水凝胶为生物材料支架、以利用优化培养基培养出的高活性兔角膜内皮细胞为种子细胞，对模型兔进行内皮损伤的组织工程修复，通过术后眼相观察、裂隙灯观察、角膜内表面扫描电镜观察和角膜纵切面组织切片观察，评价该方法的可行性。本实验得到以下结果：（1）该壳聚糖水凝胶对大鼠肝脏和脾脏未表现出明显毒性作用、对大鼠肾脏前期可引起轻微损伤，后期损伤恢复，推测为机体对水凝胶的适应反应，无蓄积毒性；该水凝胶对兔角膜内皮细胞无毒性的结论。（2）CM-CT、CS在一定浓度下（50~100μg/mL）对兔角膜内皮细胞的生长具有显著促进作用，且对细胞形态无明显影响；以一定浓度混合后，混合糖的促细胞生长作用具有协同效应。（3）行角膜内皮损伤模型的建立和修复12周后，一半实验组模型兔术眼恢复透明，镜下观察有单层新生角膜内皮、细胞呈多边形。综上，本实验可得出以下结论：该壳聚糖基水凝胶适于作为组织工程角膜内皮的生物材料支架使用；利用含CM-CT、CS的优化培养基培养兔角膜内皮细胞可明显促进其生长；利用壳聚糖基水凝胶包封兔角膜内皮细胞对角膜损伤模型兔进行组织工程修复的方法具有一定可行性。