流行性感冒是由流感病毒引起的急性呼吸道传染病，此病通过飞沫传播，传染性强，具有‘变异’特性，不断产生新的亚型，易感者众多，常容易造成爆发性流行或世界性大流行。 流行性感冒病毒简称流感病毒(InfluenzaVirus)，在病毒分类上属于正粘病毒科，是一类带包膜、基因组分节段的单链、负链RNA病毒。根据病毒粒核蛋白(NP)和膜蛋白(MP)抗原性及基因特性的不同，将流感病毒分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型。其中甲型和乙型流感病毒基因组均含有8个RNA片段，丙型含有7个RNA片段。甲型流感病毒可引起世界性流感大流行，乙型流感病毒常引起流感局部爆发流行，丙型流感病毒感染主要以散在形式发生。乙型流感病毒RNA片段7编码M1和BM2两种蛋白。基因全长1191个核苷酸，包含两个开放读码框架。突变分析显示BM2蛋白的起始密码子和M1蛋白的终止密码子是部分重叠的，序列为UAATG。这种编码策略是细菌基因表达调控中一个比较常见的现象，然而在真核细胞中，这种情况是不常见的。M1为病毒的基质蛋白，与双层类脂膜和糖蛋白突起组成病毒包膜。M1蛋白提供膜以刚性。BM2蛋白全长109个氨基酸，分子量约为12-15kDa，四聚体结构，以NoutCin的方向表达在病毒感染的细胞表面。其第7-25残基(ILSICSFILSALHFMAWTI)为疏水的跨膜区(transmembrane，TM)，仅跨膜一次，缺乏切割信号，在分类上属于Ⅲ型膜蛋白。 BM2蛋白在流感病毒生活周期中的作用目前还不太清楚。应用反向遗传技术包装BM2基因敲除的重组病毒株，不能在正常的MDCK细胞中复制。在稳定表达BM2蛋白的细胞系中可以复制。说明BM2蛋白在乙型流感病毒生活周期中是必需的成分。 本课题的目的是寻找与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白，为阐明BM2蛋白的功能提供线索。我们应用酵母双杂交技术，从人肾cDNA文库中筛选到8个能与BM2蛋白相互作用的宿主蛋白，分析其结合的部位，探讨了乙型流感病毒BM2蛋白的功能。本文为在分子水平研究乙型流感病毒在宿主细胞内的复制过程提供了有力的证据。 本研究工作主要包括以下内容：(一)应用酵母双杂交系统筛选与BM2蛋白相互作用的蛋白。为了研究病毒蛋白与宿主蛋白的相互作用，进一步阐明BM2蛋白影响病毒复制的机理，我们以BM2蛋白为诱饵，筛选人肾cDNA文库，得到162个阳性克隆。经过测定核苷酸序列，用blast比较分析，得到8个与BM2相互作用的蛋白质分子。 我们首先在酵母细胞AH109中表达BM2蛋白：将BM2基因克隆至pGBKT7载体上，在SD培养基中培养。然后裂解酵母菌以释放其中的蛋白，用Westernblot方法以BM2多抗血清和抗pGBKT7载体上BD标签的单克隆抗体均检测到阳性条带，证明BM2基因在酵母细胞中得到表达。 我们进而检测BM2基因在酵母细胞内是否有自激活现象：将BM2基因克隆至pGBKT7载体上，单独或与AD载体一起转化酵母，涂含X-α-gal的SD平板，结果没有蓝色菌落出现。表明BM2基因没有自激活现象，可以用于筛库。 随后我们建立了酵母双杂交体系：将缺失N端的BM2基因克隆到诱饵载体pGBKT7上，人肾cDNA文库片段克隆到pACT2载体上，将诱饵质粒和文库质粒共转化酵母细胞。通过在SD高严谨性选择培养基平板检测报告基因的表达来筛选阳性克隆。然后在SD选择性平板上划线分离以去除可能存在于酵母细胞中的不同AD文库质粒。从阳性酵母细胞中提取质粒，用PCR法扩增AD质粒中的外源片段。将有编码产物且读码框正确的质粒转化大肠杆菌TOP10，然后提取质粒，以AD载体酶切位点两侧特异引物测序。将测序结果在NCBI网站上作BLAST分析。 经过分析比较，我们发现了几个与BM2蛋白相互作用的蛋白质：我们以BM2(26-109)/pGBKT7为诱铒，应用酵母双杂交系统筛选人肾cDNA文库，得到了能与BM2相互作用的8种蛋白质的基因序列。将这八个质粒分别与诱饵质粒共转染酵母细胞，从而进一步验证了它们的相互作用。这些蛋白包括：N-乙酰神经氨酸酶丙酮酸裂解酶(N-acetylneuraminatepyruvatelyase)，促血管生成素3(Angiopoietin3)，锌指蛋白251(Zincfingerprotein251)，核糖体蛋白S20(RibosomalproteinS20)，蛋白精氨酸N-甲基转移酶1[ProteinarginineN-methyltransferase1variant1(PRMT)]，转录因子样蛋白1[Transcriptionfactor-like1(TCFL1)]，热应激蛋白HSP40，钠，钾ATP酶β亚基(Na，K-ATPaseβsubunit) (二)BM2蛋白与HSP40蛋白相互作用的部位的确定我们用NetworkProteinSequenceAnalysis生物软件分析BM2蛋白的二级结构：BM2二级结构中α-螺旋占64.22％，延伸链占11.93％，随机卷曲占23.85％。以α-螺旋为主，我们根据α-螺旋集中的区域设计了三段缺失突变体：BM2(27-60)，BM2(40-90)，BM2(60-109)。 我们设计了特异性引物，用PCR法得到BM2(27-60)，BM2(40-90)，BM2(60-109)三个片段，并分别克隆至pGBKT7载体上，构建了三个BM2缺失突变体。 从人肾cDNA文库中获得HSP40全基因：根据GENBANK中查到的序列，设计了特异引物，PCR扩增了HSP40的全基因。基因全长1023bp，编码340个氨基酸。我们将HSP40基因克隆到AD载体上，应用酵母双杂交技术确定了BM2蛋白与HSP40蛋白相互作用的部位。将BM2缺失突变体与HSP40共同转化酵母细胞，根据报告基因的表达，初步确定BM2蛋白的60-109氨基酸残基与HSP40相互作用。已知BM2蛋白60至109位氨基酸残基有三处磷酸化位点。这一发现为阐明BM2的功能提供了重要线索。 本研究首次报道了几个与乙型流感病毒BM2蛋白相互作用的蛋白质，为阐明BM2蛋白在病毒生活周期中的作用提供了线索。这方面的研究尚未见国外报道。我们首次确定了BM2蛋白的60-109氨基酸残基是与HSP40相互作用的部位。揭示了BM2蛋白磷酸化形式的重要性。HSP40具有分子伴侣功能，BM2蛋白通过与其结合可能发挥捕获结合其它蛋白，协助它们装配入毒粒的作用。本研究从病毒与宿主的关系角度出发，从基础研究的水平对乙型流感病毒BM2蛋白的功能作了深入的探讨，为解释病毒的致病机理，也为今后研究抗病毒机制和抗病毒药物打下良好的基础。