论文部分内容阅读
本实验以大鼠神经元细胞系PC12细胞以及大鼠脑缺血再灌注模型为对象，研究SMAD2和SMAD3在脑缺血区域的表达、调控以及其对脑梗死后炎症和细胞凋亡的影响。本实验共分3部分：1. SMAD2和SMAD3在脑缺血区域的动态表达及与炎症、凋亡的相关性。线栓法制作大鼠脑缺血再灌注模型，分别于模型制作成功后6h、24h、72h和7d时处死大鼠。RT-PCR检测SMAD2/3mRNA的表达，western blot法检测SMAD2/3蛋白以及其磷酸化蛋白的表达，Tunel染色检测凋亡细胞， ELISA法检测IL-1β的表达。结果发现模型组（model）缺血周边区域中SMAD2/3mRNA在6h时即高于对照组（control）和假手术组（sham），之后逐渐升高，至72h达到最高点，7d后下降；磷酸化SMAD2/3蛋白（p-SMAD2/3）表达趋势与mRNA一致；在缺血后6h、24h和72h时，model组缺血周边区域中SMAD2/3蛋白表达与control组和sham组相比并无明显差异，仅在7d时高于control组和sham组；SMAD3蛋白表达与细胞凋亡、炎症反应呈负相关，而SMAD2蛋白表达水平与凋亡、炎症反应并无明确相关性。此结果表明脑缺血再灌注可引起缺血周围区域中SMAD2/3表达的变化，且SMAD2/3基因表达可能受到转录后水平的调节，SMAD3可能具有抗炎、抗凋亡的神经保护作用。2. miR-145在细胞水平下调SMAD2和SMAD3蛋白的表达MicroRNA是一类长18-25nt的非编码小RNA分子，可在转录后水平调节基因的表达。在脑缺血再灌注后，缺血周围区域可出现一系列microRNA表达水平的变化。我们推测在脑缺血再灌注后，SMAD2/3蛋白和mRNA表达之所以不平行，可能受到了microRNA的调节。因此，我们通过数据库搜索发现，miR-145理论上可同时结合SMAD2和SMAD3mRNA的3’-UTR端。之后，我们构建了含SMAD2/3mRNA3’-UTR端的荧光报告载体，将其与miR-145的抑制剂（inhibitor）和激动剂（mimic）共转染后测定miR-145对荧光素酶活性的影响，结果发现miR-145inhibitor可上调荧光素酶活性，而miR-145mimic下调荧光素酶活性。对报告载体上miR-145结合位点进行点突变后，其荧光素酶活性不受miR-145mimic和inhibitor的影响。转染miR-145mimic和inhibitor后，PC12细胞中SMAD2和SMAD3蛋白明显下调。这些结果表明了miR-145在细胞水平上通过转录后机制调节SMAD2/3蛋白的表达，这可能是脑缺血再灌注后SMAD2/3mRNA和蛋白表达并不平行的原因。3.过表达脑内SMAD3蛋白表达减轻脑缺血再灌注后神经细胞的凋亡和缺血区域的炎症反应。我们将含有SMAD3cDNA的腺病毒质粒注射至大鼠侧脑室内，利用转基因技术研究SMAD3蛋白对脑缺血再灌注后细胞凋亡和炎症反应的影响。结果发现与干预的脑缺血再灌注大鼠模型相比，过表达SMAD3表达后，缺血区域tunel染色阳性细胞数明显减少，caspase3水平下降而Bcl2水平上升，TNF-α和IL-1β mRNA的表达也明显减少。该结果表明SMAD3具有抗凋亡、抗炎的神经保护作用，可作为临床治疗脑梗死的潜在药物作用靶点。