血吸虫病是一种严重危害人民健康,影响社会经济发展的重大传染病。主要分布于非洲、中东、南美和东南亚的76个国家和地区。在东南亚,目前血吸虫病主要流行于5个国家,即中国、菲律宾、印尼、柬埔寨和老挝。虽然经过几十年持续的防治,主要是大规模的人群化疗,各国流行区人群的感染率都比较低,但是流行的状况不稳定。我国为日本血吸虫病流行区。2008年全国调查资料显示,共有现症患者40余万,受威胁人口1亿。血吸虫病引起政府的高度重视,确定为重点防治的传染性疾病之一。我国血吸虫病防治工作面临的主要问题,包括重复感染严重存在、唯一有效化疗药吡喹酮的长期使用可能产生抗药株、大量哺乳动物保虫宿主的存在。因而寻找长效防治措施成为主要目标。疫苗预防作用被作为血吸虫病综合防治重要的措施之一而倍受关注。世界卫生组织(WHO)专家认为,化疗手段(短效)必须与长效的措施(疫苗)相结合。在疫苗研制的依据上,多年的探索表明,至少在啮齿类和灵长类的某些动物模型,获得性免疫应答可杀灭血吸虫。但是,尽管历经半个世纪的努力,血吸虫病疫苗目前仍然没有取得突破性进展,部分原因在于血吸虫在长期与宿主的共进化过程中,建立起复杂的保护体系,抵御和防御宿主免疫系统的攻击。在日本血吸虫病疫苗领域,近年来最大的进展在于克隆了数以百计的候选抗原,但单一候选抗原分子诱导的保护力鲜有超过40%。而世界卫生组织曾经公布的被认为最有希望的6种曼氏血吸虫病的候选抗原已全部完成测试,无一能稳定诱导40%以上的保护力。WHO认为可能是抗原供应前后制剂稳定性差,以及抗原和佐剂质控不严所致。多年的研究提示抗原递呈作用的重要性,佐剂的选择和免疫接种方案优化也需进一步探讨。树突状细胞是机体免疫系统岗哨工作的承担者,对自身或来自外界的抗原进行识别和加工。它们不仅识别加工抗原,还能活化初始T细胞,并且调节T细胞应答的性质,即诱导免疫耐受或是使免疫向Thl/Th2方向极化。DC这些重要的生物功能使通过对DC干涉调节免疫应答成为可能。目前已知,佐剂可通过激活DC而增强抗原应答,DC本身也被称为天然佐剂。经抗原体外刺激的DC免疫机体后可有效地诱导T细胞依赖的免疫力,还可诱导小鼠产生强的抗体应答。目前,基于DC的治疗和免疫预防广泛用于癌症和感染性疾病,取得显著进展。在血吸虫候选抗原中,谷胱甘肽S转移酶GST被认为是最有前途的候选抗原。有鉴于此,本文尝试用GST负载的树突状细胞联合CpG ODN免疫小鼠,研究其诱导的体液免疫和细胞免疫,并评价其免疫保护力。研究共分三部分：一日本血吸虫抗原负载树突状细胞的实验研究含日本血吸虫大陆株26kDa GST抗原基因的工程菌(Sj26GST/PBV220/DH5α)温控表达后,超声粉碎,应用亲和层析法纯化出重组GST抗原(简称GST),并经SDS-PAGE和Western blotting鉴定。可溶性虫卵抗原按常规制备。共采用两种树突状细胞进行血吸虫抗原负载的研究。小鼠骨髓来源树突状细胞(BMDC)制备培养方法参照文献,用IL-4和GM-CSF诱导培养。培养至第7天调整细胞浓度至2×105/ml接种于24孔培养板,每孔1ml。分别加入不同浓度的SEA、GST刺激细胞,并设LPS和PBS对照组。流式细胞仪检测树突状细胞表面分子CD40、 CD80、CD86的表达情况。结果表明,同本血吸虫抗原GST负载BMDC的最适浓度为1μg/ml.与LPS刺激不同,SEA、GST负载BMDC后,BMDC表面分子CD40、CD80、CD86表达并未上调,表现为不成熟表型。树突状细胞DC2.4按常规方法培养。分别加入不同浓度的GST进行抗原负载,比较树突状细胞表面分子CD40、CD80、CD86的表达水平。FITC标记的抗GST单克隆抗体检测GST抗原负载的情况。荧光显微镜下观察GST抗原负载的树突状细胞内可见特异的绿色荧光,表明抗原被细胞所摄取。流式细胞术分析结果表明,抗原刺激DC2.4的最适浓度为10μg/ml。日本血吸虫抗原GST、SEA负载DC2.4后,可检测到DC2.4表面CD40、CD86分子的平均荧光强度增强,而CD80增强不明显。二负载GST抗原的树突状细胞疫苗联合CpG-ODN免疫小鼠对日本血吸虫感染的保护性效应研究比较两种不同CpG ODN序列对树突状细胞DC2.4的刺激效果。流式分析结果表明,CpG ODN最佳刺激浓度为0.5μM, CpG0ODN1序列促DC成熟效果要优于CpG0DN2,且能进一步促进GST负载的树突状细胞的成熟。动物实验共分7组,每组小鼠10只,分别为：DC免疫组、BSA刺激DC免疫组、GST刺激DC免疫组、GST+CpG ODN刺激DC免疫组、CpG ODN刺激DC免疫组、GST蛋白免疫组、不免疫对照组(以下简称DC、BSA-DC、GST-DC、GST+CpG ODN-DC、CpG ODN-DC、GSTpr组)。1-5组每鼠皮下注射1×10。个细胞,共免疫三次,每次间隔两周。第6组第一次每鼠免疫50μg蛋白加完全弗氏佐剂,第二次免疫50μg蛋白加不完全弗氏佐剂,第三次免疫10μg蛋白加不完全弗氏佐剂。末次免疫两周后,每组半数小鼠留作细胞免疫相关检测分析。其余小鼠经皮肤感染30条尾蚴。每次免疫前及攻击感染前采血。攻击感染6周后门静脉灌注法收集成虫,计算减虫率。收集肝脏计数虫卵,计算每克肝组织的虫卵数(EPG)和减卵率。结果：与对照组比较,DC、BSA-DC、GST-DC、 GST+CpG ODN-DC、CpG ODN-DC和GSTpr组小鼠的减虫率分别为9.33%、2.7%、21.33%、53.33%、0和24%,减卵率分别为10.76%、19.37%、39.05%、64.24%、33.64%和34.90%,GST+CpG ODN-DC组小鼠有显著的减虫和减卵效果(P<0.05)。三GST抗原负载树突状细胞疫苗联合CpG ODN对日本血吸虫感染的免疫保护机制研究ELISA方法检测免疫血清特异性抗体及其亚类。结果表明,三次免疫后,GST蛋白免疫组产生的抗体滴度最高,并明显高于其他各组。GST-DC组和GST+CpG ODN-DC细胞免疫组的抗体滴度也明显提高,加强免疫后抗体亚类IgGl、IgG2a水平呈现上升趋势。末次免疫后每组小鼠各取5只,分别取小鼠脾脏和淋巴结,制备单细胞悬液。CCK-8法检测淋巴细胞增殖情况。结果表明,抗原刺激后,GST-DC组、GST+CpG ODN-DC组有较明显的增殖。淋巴细胞分离液分离脾脏淋巴细胞,同时以GST抗原(15μg/m1)体外刺激细胞,收集48h、72h和96h培养上清,ELISA法检测诱生的IL-4、IFN-γ和IL-10细胞因子水平。结果表明,与对照组相比,各组IL-4、IL-10水平并未明显提高,组间无明显差异；而相比对照组,GST+CpG ODN-DC组和GST-DC组IFN-γ水平均显著提高,与对照组相比上升了10倍(P<0.05)。上述结果表明,GST+CpG ODN-DC和GST-DC疫苗免疫C57BL/6小鼠后,诱导了体液免疫和细胞免疫应答,以Thl型细胞免疫为主导。