埃博霉素生物合成的胞外诱导机制分析

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首先通过液体透析共培养成功建立了在液体培养基中研究微生物种间相互作用的方法。通过这种共培养方法对36种种间微生物进行了筛选,筛选出了一株能够使纤维堆囊菌合成埃博霉素产量提高6%-9%的辅助微生物——LDF#-放线菌02,通过对该微生物的分子生物学菌种鉴定确定其为细黄放线菌5406。使用DMSO、甲醇和乙酸乙酯制备了该放线菌的粗提物,并通过添加实验探索了三种粗提物分别对埃博霉素合成的促进作用,结果表明甲醇粗提物的促进作用最明显,能够提高产量20%左右。又进一步对甲醇粗提物的添加量进行了实验,发现在一定范围内(体积比0.02%-0.3%)不同甲醇添加量对埃博霉素合成的促进作用差别不大,均能达到20%左右。后又通过对添加甲醇粗提物和单纯加入甲醇对埃博霉素合成的促进作用进行对比,发现甲醇与甲醇粗提物的促进作用几乎无差别,证明是甲醇作为小分子诱导物在促进埃博霉素合成中发挥了重要作用。通过对其它小分子物质对埃博霉素合成的影响筛选发现,甲醇对纤维堆囊菌产埃博霉素的促进作用是具有相对专一性的,用于实验筛选的其它小分子物质没有这种促进作用。而且由于甲醇的添加量只有0.05%左右,可以排除甲醇可能作为纤维堆囊菌生长代谢过程中的碳源和能源等发挥作用,更大的可能是甲醇作为信号分子或者某些酶的特异性诱导物改变了纤维堆囊菌某一或者某几个代谢途径而导致了埃博霉素A和B整体产量的提升。通过对甲醇添加时间和添加量的进一步优化表明,在接种前加入体积比0.05%的甲醇对埃博霉素合成的促进作用最大最稳定,同时发现甲醇对埃博霉素的促进作用与菌体的整体代谢强度和生产能力有关,当对照组产量较高时,甲醇对埃博霉素的提升幅度更大,提升幅度能达到40%左右,说明甲醇提升产量作用具有放大效应,这更有利于在目前已确定的稳定高产量生产工艺的基础上继续对埃博霉素产量的大幅度提升。通过分子生物学手段对甲醇促进埃博霉素合成进行分析,纤维堆囊菌生长代谢中通用关键酶的RT-q PCR基因表达量差异分析表明甲醇对几种关键酶的基因表达量的差异影响不明显。继续通过转录组基因表达差异分析发现,甲醇的添加影响了合成埃博霉素途径中的相关基因的表达量的上调和下调,表达上调的基因共197个,表达下调的基因共190个,对差异表达基因根据条件|log2(fold change)|和FDR<0.05进行显著性筛选,发现甲醇组较空白组显著上调的两个基因分别编码ATP依赖的分子伴侣Clp B和钠转运焦磷酸酶。甲醇引起纤维堆囊菌菌体内这两个基因表达上调的最终结果应该是,通过提高QS系统信号分子的前导肽修饰加工,增强了纤维堆囊菌合成埃博霉素相关代谢流,具体数据有待进行RT-q PCR验证后得出最终结论。本研究获得的数据将为阐明小分子体外诱导物对纤维堆囊菌过表达埃博霉素类目标产物的深入机理研究奠定基础。
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