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本研究旨在:Ⅰ.克隆大豆油酸脱饱和酶基因fad2-1及其片段,构建其反义基因表达载体,转化根癌农杆菌LBA4404,获得工程菌,为通过农杆菌介导方法培育大豆新品种提供理论和技术依据,而且为进一步探讨反义RNA的全长序列或是片段可以有效的发挥抑制作用提供一定的实验基础。Ⅱ.建立河南部分栽培大豆遗传多样性的RAPD分子标记体系,为其育种和品种鉴定提供了理论和技术依据。研究取得的主要结果如下:
(1)根据NCBI报道的大豆fad2-1基因序列,设计出两对有效的引物,用PCR方法从大豆基因组DNA中分离克隆了fad2-1基因1196bp的全长序列和656bp的片段;
(2)将fad2-1基因的全长序列和片段用SalⅠ和BamHⅠ双酶切后反向插入经SalⅠ和BamHⅠ双酶切的pBt植物表达载体中,构建了含有反义基因的植物表达载体;
(3)采用冻融法将含有反义fad2-1基因的全长序列和片段的植物表达载体转入农杆菌LBA4404,经过抗性筛选、双酶切分析和PCR鉴定,获得了农杆菌LBA4404工程菌;
(4)建立了适合河南大豆遗传多样性的RAPD分析体系;并用该体系从73种随机引物,经过二次筛选,得到12种随机引物扩增出了较稳定的DNA条带,大小在0.2~5Kb之间;每种引物扩增出的条带数在4~9条之间,共计扩增出67条带,其中多态性条带51条,多态性指数为76.12%。利用SPSS11.0软件进行统计分析和聚类分析的结果表明所有样品的相似系数都在0.528和0.776之间,平均相似系数为0.6416,并得到了它们的聚类树状图。通过对该图分析可知:这些材料可聚成3组,各组内品种(系)体现了一定的相关性。