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目的:缺血性脑卒中是一种常见的神经系统疾病,也是导致永久性残疾的主要原因之一。然而,目前可用的临床治疗方法,如溶栓治疗,受到时间窗和急性期疗效不佳的限制。因此,寻找新型治疗方法来减轻脑缺血后神经元损伤非常重要,因为神经元损伤的程度是决定预后的主要因素。目前,只有少数药物可以缓解卒中后的神经功能损伤,因此寻找新型治疗方法至关重要。环状RNA（circular RNA,circ RNA）是一种新近发现的内源性非编码RNA,其特征在于由反向剪接形成的连续闭合环。虽然circ RNA的生理功能尚未完全确定,但许多circ RNA在大脑中高表达,研究表明circ RNA参与神经发育以及多种神经系统疾病。早期研究表明,短暂性脑缺血后circ RNA的表达谱中circCCDC6在短暂性大脑中动脉闭塞（t MCAO）大鼠模型的大脑中上调。然而,circCCDC6在缺血性脑卒中相关神经元损伤中的潜在作用仍然未知,尤其是在神经元损伤方面需要进一步确定。因此,本研究首先建立大脑中动脉闭塞/再灌注（MCAO/R）大鼠模型和经氧糖剥夺/再灌注（OGD/R）处理的SH-SY5Y细胞模型。检测了两种模型中circCCDC6的表达,并通过功能丧失和功能获得实验阐明了circCCDC6参与神经元细胞焦亡和炎症机制。探讨circCCDC6作为脑缺血神经损伤的生物标志的潜力。为阐明circ RNA在脑缺血损伤中的功能提供新的理论支持,有助于深入理解缺血性脑卒中病理生理的调控机制,为今后寻找基于circ RNA的缺血性脑卒中生物标志物和治疗靶点奠定基础。方法:一、circCCDC6在脑缺血再灌注损伤中的作用1、体内实验构建MCAO/R大鼠动物模型。敲低circCCDC6改善大鼠局灶性脑缺血后的神经功能缺损:实验分组包括假手术组、MCAO/R组、MCAO/R-对照注射组和MCAO/R-敲低circCCDC6组。q PCR检验各组circCCDC6表达,确定敲低效率;通过改善神经功能缺损评分评估各组大鼠神经功能缺陷情况;通过Nissl染色显示脑的基本神经结构并检测神经细胞损伤情况。在细胞焦亡期间,GSDMD介导膜孔的形成。因此,我们对GSDMD进行了免疫组化染色;TUNEL染色判定大鼠脑组织中TUNEL染色阳性细胞数量评估神经元凋亡情况;ELISA检测炎性因子IL-1β、IL-18的表达;WB检测IL-1、IL-18炎性因子及cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达。2、体外实验采用氧糖剥夺/再灌注诱导OGD/R模型。实验分组包括对照组、OGD/R组、OGD/R-对照组和OGD/R-过表达circCCDC6组。在转染pc DNA 3.1-circCCDC6后q PCR检测各组circCCDC6表达以确定转染效率。用CCK8法检测神经元活性。试剂盒检测LDH释放量评估细胞毒性。此外,进一步通过流式细胞术分析OGD/R处理后各组caspase-1阳性细胞的百分比;ELISA测定各组IL-1β和IL-18的含量;WB检测各组IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达。二、circCCDC6调控脑缺血再灌注损伤的机制1、为了研究circCCDC6的下游靶点,通过生物信息学网站预测https://starbase.sysu.edu.cn/与circCCDC6结合的miRNA及结合位点。q PCR检测对照组或MACO/R大鼠和OGD/R神经元中miR-128-3p的表达情况。将WT-circCCDC6/MUT-circ C CDC6与miR-128-3p模拟物或对照质粒共转染,双荧光素酶报告实验检测荧光素酶活性。RIP实验分析circCCDC6和miR-128-3p的结合情况。随后,q PCR检测在ci rc CCDC6的敲低或过表后各组miR-128-3p的表达。2、随后探讨miR-128-3p在OGD/R诱导的神经元细胞焦亡和炎症中的作用。在SH-SY5Y细胞中转染miR-128-3p模拟物和抑制剂,实验分组包括模拟物-对照组、miR-128-3p模拟物组、抑制剂-对照组、miR-128-3p抑制剂组。q PCR检测各组SH-SY5Y细胞中各组的miR-128-3p表达以确定转染效率。用CCK8法检测各组神经元活性。试剂盒检测LDH释放量评估各组细胞毒性。流式细胞术检测各组caspase-1阳性细胞百分比,ELISA检测各组IL-1β和IL-18含量以及WB测定各组IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达。3、TXNIP已被证明是I/R损伤中的促炎因子,TXNIP/NLRP3炎症体途径的激活是细胞焦亡的关键因素。WB检测体内外模型及相应对照组中TXNIP的表达。关于miR-128-3p介导的TXNIP表达变化,进行WB检测转染miR-128-3p模拟物或miR-128-3p抑制剂后神经元中TXNIP的蛋白水平。生物信息学网站搜索miR-128-3p和TXNIP 3’UTR的互补序列,随后通过双荧光素酶报告分析和RIP实验确定其靶向关系。4、最后,进行拯救实验以确定circCCDC6/miR-128-3p/TXNIP/NLRP3轴对OGD/R诱导的神经元细胞焦亡和炎症的影响。实验分组为:si-NC组、si-circCCDC6+pc DNA3.1组和si-circCCDC6+pc DNA3.1-TXNIP组。经q PCR检测各组miR-128-3p的表达;WB检测各组TXNIP的表达。在功能上,CCK8测定各组细胞活力;试剂盒检测各组LDH释放量评估细胞毒性;流式细胞术检测caspase-1阳性细胞百分比;ELISA测定各组IL-1β和IL-18的含量WB测定IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达。结果:一、circCCDC6在脑缺血再灌注损伤中的作用体内实验:（1）注射sh RNA-circCCDC6后,MCAO/R处理诱导的circCCDC6的促进表达受到抑制;（2）神经功能评估表明,MCAO/R大鼠有严重的神经损伤,可通过敲低circCCDC6来减轻;（3）Nissl染色进一步显示,MCAO/R大鼠的神经元肿胀,细胞质空泡化,Nissl小体数量减少,敲低circCCDC6可缓解这些症状;（4）MCAO/R处理增加了GSDMD的荧光强度,但这一趋势因circCCDC6基因敲除而受到限制;（5）接受MCAO/R手术的大鼠脑组织中TUNEL阳性细胞数量增加,IL-1β和IL-18的释放增多,IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达升高;当circCCDC6被敲低时,MCAO/R引起的变化全部逆转。体外实验:（1）在转染pc DNA 3.1-circCCDC6后,OGD/R处理诱导的神经元中circCCDC6表达进一步升高;（2）OGD/R模型神经元活力受到抑制,LDH释放增加,而circCCDC6的过度表达对其有增强的影响;（3）OGD/R处理可诱导神经元中caspase-1阳性细胞的百分比、IL-1β和IL-18的含量以及IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达增加;此外,circCCDC6上调进一步促进了所有这些改变。二、circCCDC6调控脑缺血再灌注损伤的机制1、预测有20个miRNA可能与circCCDC6结合,其中miR-128-3p尤为突出;miR-128-3p和circCCDC6在chr10:61564232-61564251[-]处有结合位点。据报道,miR-128-3p在脊髓I/R损伤中下调,其过度表达能够改善神经炎症和凋亡。本研究也获得了类似的结果,在MACO/R大鼠和OGD/R神经元中miR-128-3p均下调。双荧光素酶报告实验表明,将circCCDC6与miR-128-3p模拟物共转染可降低荧光素酶活性,RIP实验进一步支持Ago2组的circCCDC6和miR-128-3p增加。circ CDC6的敲低或过度表达分别上调和下调miR-128-3p的表达。综上所述,circCCDC6竞争性结合miR-128-3p。2、转染miR-128-3p模拟物和抑制剂分别上调和下调OGD/R诱导的神经元细胞中的miR-128-3p表达。miR-128-3p上调后,神经元活力增加,LDH释放减少,caspase-1阳性细胞百分比、IL-1β和IL-18含量以及IL-1β、IL-18、cleaved caspase-1、ASC和NLRP3的蛋白表达均降低;而miR-128-3p的敲低具有完全相反的作用。总之,miR-128-3p参与调节神经元细胞焦亡和炎症。3、体内和体外模型中,发现TXNIP表达增加。转染miR-128-3p模拟物或miR-128-3p抑制剂可分别降低和增加神经元中TXNIP的蛋白水平。生物信息学网站搜索miR-128-3p和TXNIP 3’UTR的互补序列,随后通过双荧光素酶报告子分析和RIP实验确定其靶向关系。简而言之,miR-128-3p与TXNIP 3’UTR的结合具有靶向关系。4、敲低circCCDC6可促进miR-128-3p的表达,而TXNIP的过度表达对miR-128-3p的表达无影响;通过过表达TXNIP,可逆转circCCDC6敲低诱导的TXNIP蛋白表达抑制。在功能上,当TXNIP上调时,circCCDC6敲低介导的对细胞焦亡和炎症的保护作用被阻止。显然,circCCDC6通过调节miR-128-3p/TXNIP/NLRP3通路影响神经元细胞焦亡和炎症。结论:本研究的结果表明,（1）敲低circCCDC6可以改善MCAO/R诱导神经元损伤的细胞焦亡和炎症。（2）离体水平中,circCCDC6的过度表达加重了OGD/R诱导的神经元细胞焦亡和炎症。（3）在机制上,circCCDC6介导miR-128-3p并激活TXNIP/NLRP3,从而促进OGD/R诱导的神经元细胞焦亡和炎症。CircCCDC6可能为MCAO/R的治疗提供一种新的策略。