中华绒螯蟹PDGF/VEGDF和Astakine基因的克隆表达及功能研究

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中华绒螯蟹是我国重要的水产经济动物,但近年来疾病的频繁发生给养殖业造成了巨大的经济损失,目前病害问题已经成为严重制约水产养殖业健康发展的主要障碍。从中华绒螯蟹机体本身入手,研究其免疫防御机制,从而制定合理的“绿色、环保”的养殖策略,对水产养殖的可持续发展及人类健康都具有重要意义。细胞因子作为免疫活性细胞间相互作用的介质,对免疫应答的发生、调节及效应等均起重要作用。他们参与许多细胞过程,如细胞增殖,分化,细胞膜表面的受体激活及细胞因子有关的基因调控。   本研究采用大规模EST测序方法,结合cDNA末端快速扩增(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术从中华绒螯蟹中克隆到了PDGF/VEGF和Astakine基因的cDNA全长序列:采用实时荧光定量PCR技术检测了这两个基因在健康个体中的组织分布以及鳗弧菌和酵母菌刺激后血淋巴细胞中的时序表达规律;同时,将PDGF/VEGF的编码区克隆到pET30(a+)载体中,在大肠杆菌中实现了重组表达,并进行了体外活性检测。   本研究从中华绒螯蟹中克隆了PDGF/VEGF(命名为EsPDGF/VEGF),其cDNA全长为1773bp,5’非翻译区为54bp,开放阅读框为588bp,编码一条由196个氨基酸残基组成的多聚肽,其理论分子量为20.2kDa,等电点为7.46,3’非翻译区为1131bp。经SignalP和SMART预测有一个信号肽及典型的PDGF结构域。推导的EsPDGF/VEGF氨基酸序列与其他已知的PDGF/VEGF氨基酸序列具有一定的同源性。采用实时荧光定量PCR技术检测组织分布显示,EsPDGF/VEGF在血淋巴、肝胰腺和肌肉组织中的表达量较高,在性腺、腮和心脏组织中的表达量较低。在中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激后,EsPDGF/VEGF的表达量在24hr时与空白组相比具有极显著性差异:受到酵母菌刺激后,EsPDGF/VEGF基因的表达量与空白组相比在3hr时具有极显著性差异,在12、24和48hr时具有显著性差异,表明该基因参与中华绒螯蟹对入侵病原菌的防御反应。当中华绒螯蟹受到损伤刺激时,EsPDGF/VEGF的表达量在8hr时达到了空白组的2269倍,说明EsPDGF/VEGF参与了中华绒螯蟹机体损伤的组织修复。将EsPDGF/VEGF的编码区片段重组到nET-30(a+)载体上,在BL21(DE3)中表达重组蛋白,该重组蛋白对生物胺(多巴胺、肾上腺素和去甲肾上腺素)的释放有促进作用。   本文克隆了中华绒螯蟹Astakine基因(命名为EsAstakine)cDNA序列。cDNA全长1163bp,5’非翻译区为120bp,开放阅读框为387bp,编码128个氨基酸,其理论分子量为31.8,等电点为5.18,3’非翻译区为656bp。经SignalP预测没有信号肽,但是经SMART程序预测EsAstakine有一个prokineticin结构域。推导的EsAstakine氨基酸序列与其他已知的Astakines氨基酸序列具有一定的同源性。采用实时荧光定量PCR技术检测组织分布显示,EsAstakine在血淋巴、性腺、肝胰腺和肌肉组织中的表达量较高,在心脏和腮组织中的表达量较低。中华绒螯蟹受到鳗弧菌刺激24和48hr时,EsAstakine基因的表达量与空白组相比具有极显著差异;在受到酵母菌刺激1.5和24hr时,EsAstakine基因的表达量与空白组相比具有显著差异,在12hr时具有极显著差异,此现象揭示该基因参与中华绒螯蟹对入侵病原菌的防御反应。
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