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坏死梭杆菌(Fusobacterium necrophorum)是引起绵羊腐蹄病和肝脓肿等疾病的常见病原菌之一,所致疾病给养羊业造成很大的经济损失。该病原产生的白细胞毒素是分泌毒素最强的毒力因子之一,能抑制中性粒细胞的吞噬作用,为细菌侵入宿主体内提供协助作用,从而导致疾病的发生。由于白细胞毒素的抗原表位区较分散,其中相对较集中的2407~2695之间的氨基酸序列还未见报道。因此,本研究拟从绵羊腐蹄病病料中分离坏死梭杆菌并开展白细胞毒素免疫原性的研究,以期为今后制备坏死梭杆菌所致疾病的有效疫苗奠定基础。(1)严格遵循厌氧条件下从病料中分离培养细菌,通过形态学观察、PCR扩增和系统发育树分析对分离菌株进行检测。结果显示:从感染腐蹄病的绵羊蹄部分离出长丝串珠状结构的菌体,经PCR扩增可知该分离株为坏死梭杆菌阳性,从系统发育树可知该分离株上传所得序列(KY808973)与澳大利亚分离株A39A8(JX678850.1)的亲缘关系最近,同源性达99%。(2)应用DNA star软件,依据坏死梭杆菌白细胞毒素全长基因的抗原表位区和开放性阅读框筛选出一段基因,依此设计引物来扩增目的基因,并将其克隆到pET-32a(+)表达载体上获得重组质粒,转化到表达菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导获得蛋白表达,纯化出的蛋白通过Western-blot检测其反应原性。结果表明:重组蛋白主要以可溶性的形式表达,分子量大小约为35 ku,将其命名为lkt A35;Western-blot检测显示,重组蛋白可以与全菌灭活苗制备的高免血清结合,具有较好的反应原性。(3)用获得的重组蛋白与弗氏佐剂乳化后,免疫小鼠3次,制备多克隆抗体,用间接ELISA检测其抗体效价。结果显示:二免和三免的抗体效价分别达到1:64 000和1:128 000,表明本试验获得的多克隆抗体具有较高的抗体效价。