【摘 要】
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目的:糖尿病足溃疡是糖尿病的常见并发症,伤口的溃烂、不愈严重影响着患者的健康,许多学者致力于解决慢性伤口难愈合的问题,就影响伤口愈合的不同因素,开展了大量致力于糖尿病足的研究,但目前还没有出现一个有效的药物,来改善糖尿病伤口的愈合情况,所以本课题的研究目的在于,建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,研究IL-33促进伤口愈合的机制,为糖尿病伤口愈合提供新的治疗方法。方法:1.表达rhmat IL-33蛋白:
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目的:糖尿病足溃疡是糖尿病的常见并发症,伤口的溃烂、不愈严重影响着患者的健康,许多学者致力于解决慢性伤口难愈合的问题,就影响伤口愈合的不同因素,开展了大量致力于糖尿病足的研究,但目前还没有出现一个有效的药物,来改善糖尿病伤口的愈合情况,所以本课题的研究目的在于,建立糖尿病小鼠皮肤损伤模型,研究IL-33促进伤口愈合的机制,为糖尿病伤口愈合提供新的治疗方法。方法:1.表达rhmat IL-33蛋白:本课题从Gene Bank数据库中获得人成熟IL-33蛋白c DNA序列,将序列插入p ET-28a（+）载体,构建rhmat IL-33（重组人成熟IL-33）表达载体;质粒转入大肠杆菌BL21（DE3）中表达,并对IPTG诱导温度和时间进行优化;应用镍柱亲和层析纯化重组蛋白,SEC-HPLC检测重组蛋白纯度。2.细胞实验鉴定rhmat IL-33活性:通过细胞实验检测rhmat IL-33蛋白的生物学活性。通过检测rhmat IL-33蛋白能否刺激Raw 264.7细胞分泌TNF-α（肿瘤坏死因子-α）,鉴定rhmat IL-33的细胞因子活性;通过HSF（人皮肤成纤维细胞）和Haca T（人永生化角质形成细胞）细胞划痕实验,检测rhmat IL-33是否具备促迁移活性。3.rhmat IL-33对糖尿病小鼠伤口愈合的作用:使用STZ（链脲佐菌霉素）建立糖尿病小鼠模型,血糖浓度超过16.7 mmol/L即为糖尿病小鼠。在野生型（WT）和糖尿病模型（DM）小鼠背部建立全皮层损伤,将小鼠分为WT、WT+rhmat IL-33、DM、DM+rhmat IL-33四组,伤口局部外用rhmat IL-33蛋白（10μl,1μg）或者PBS（10μl）,一天一次连续7天。比较伤口面积,评估rhmat IL-33蛋白的促愈合效果;对伤口组织进行HE染色,比较伤口角质形成细胞的增殖情况,探究rhmat IL-33蛋白对角质形成细胞的作用。4.rhmat IL-33促进伤口愈合的机制:通过流式细胞术,比较伤口中ILC2（二型固有淋巴细胞）比例,探究局部rhmat IL-33治疗对ILC2细胞的影响;通过RT PCR检测伤口组织中M2巨噬细胞经典激活剂IL-13、IL-4,M2巨噬细胞相关基因ArgⅠ、YM1,合成细胞外基质（ECM）相关基因CollagenⅢa的表达情况,探究rhmat IL-33的作用。结果:1.表达rhmat IL-33蛋白:rhmat IL-33在大肠杆菌中为可溶性表达,最适表达条件为37℃下,诱导6 h,rhmat IL-33蛋白表达量约达到菌体总蛋白的70%;应用镍柱亲和层析,使用100m M和300 m M浓度咪唑溶液洗脱得到rhmat IL-33蛋白,纯度接近100%。2.细胞实验鉴定rhmat IL-33活性:rhmat IL-33蛋白可刺激Raw 264.7细胞分泌TNF-α,且有明显的浓度依赖性;rhmat IL-33蛋白可促进HSF和Haca T细胞迁移。3.rhmat IL-33对糖尿病小鼠伤口愈合的作用:比较伤口闭合速率显示,rhmat IL-33给药明显促进了WT+rhmat IL-33组和DM+rhmat IL-33组的伤口闭合。伤口组织HE染色显示,给药组的伤口部位角质形成细胞明显增多。4.rhmat IL-33促进伤口愈合的机制:损伤后第7天,WT+rhmat IL-33组小鼠伤口皮肤中ILC2细胞的比例明显高于WT组（P<0.001）,DM+rhmat IL-33组ILC2比例也显著高于DM组（P<0.05）;rhmat IL-33给药组的IL-13、IL-4的表达上调,但无显著性差异;ArgⅠ、YM1（P<0.05）和CollagenⅢa（P<0.05）的表达量升高。结论:1)成功得到了重组人成熟IL-33蛋白,纯度接近100%。2)rhmat IL-33蛋白可以促进TNF-α分泌和细胞迁移。3)rhmat IL-33可以加快小鼠皮肤伤口愈合,特别是促进糖尿病小鼠伤口愈合。4)rhmat IL-33的促愈合机制可能是通过增加伤口组织中ILC2细胞比例,促进M2巨噬细胞经典激活剂IL-13、IL-4,M2巨噬细胞相关基因YM1、ArgⅠ和ECM合成相关基因CollagenⅢa的表达,促进修复。
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