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在口腔修复领域,足够的牙槽骨量是义齿修复的基础,无论任何修复方式都需要患者的口腔骨条件具有一定的高度、宽度和密度,才能够提供足够的固位力,保证义齿修复的效果和远期的稳定性。常见口腔科的疾病,如颌骨骨髓炎、恶性肿瘤都会引起牙槽骨的破坏和吸收,影响义齿修复,进而影响患者的生活质量。在系统的全身疾病中,骨质疏松症是影响更年期女性和老年人的重大疾病。骨质疏松症因为引起骨量减少和丧失引起肢体运动障碍和功能丧失,也成为急需攻克的医学难题。在骨形成代谢中,骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)是一类非常重要的蛋白家族,是影响骨代谢和形成的重要环节。BMP是一类转化生长因子,在多种脏器发育过程中促进细胞的分化增殖,尤其在骨发育重建过程中作用明显。BMP具有很多的亚型,参与多种生物调节过程。其中BMP4作为BMP家族中的一员,在骨形成增殖和分化过程中发挥至关重要的作用,是成骨信号的始动环节和关键靶点。本研究以BMP4为靶点,寻找能够活化BMP4的天然中药激活剂;并揭示所筛选到的中药组分与甾体类激素的协同作用激活Smad和碱性磷酸酶成骨信号的分子机制;以发现促进骨形成和骨代谢的中药激活剂,从而开发新型成骨中药。实验前,实验组成员经相关数据库查找BMP4启动子序列,并设计BMP4启动子引物,以人类基因组为模板进行PCR,扩增出人类BMP4启动子序列,长度为1581bp,位置在BMP4启动子转录起始位点上游第1441个碱基到转录起始位点下游第139个碱基。PCR产物回收后与pGEM-TEasy载体连接,并转化连接产物到感受态大肠杆菌DH5α中,后经筛选、培养、提取、酶切鉴定及测序,成功构建了 pGEMT-BMP4p重组质粒。最后,将pGEMT-BMP4p重组质粒和pGL-2载体分别进行SacⅠ和NheⅠ双酶切后连接,进行转化、培养和提取,并行酶切鉴定和测序,成功构建了 pGL2-BMP4p启动子荧光素酶报告基因重组质粒。首先,我们采用上述课题组成功构建的重组质粒筛选近百种天然中药,发现黄芪、西洋参和当归等成分可显著激活BMP4启动子报告基因,提示这三种中药成分激活BMP4基因转录,在转录水平上对BMP4发挥作用。继而,我们通过Western blot实验研究相关中药对BMP4蛋白水平上的作用,发现黄芪、西洋参和当归能够明显增强BMP4蛋白表达。而后我们又通过Western blot方法发现三种中药对BMP4蛋白表达的促进作用具有剂量依赖性。BMP-Smad信号通路是骨形成代谢核心的信号途径。Smad家族在诸多的生物学行为中发挥调控作用,其中与骨代谢密切相关的是Smad1/5/8和Smad4。为了探索药物成分对BMP-Smad信号通路的作用,我们进一步在细胞水平应用免疫荧光方法,检测黄芪、西洋参和当归等成分对Smad1/5/8和Smad4定位的影响,发现空白对照组中Smad1/5/8和Smad4呈现细胞浆浓染,给药组中Smad1/5/8和Smad4呈现向细胞核内转入增多趋势,且呈现细胞核内共定位的现象。这说明,黄芪、西洋参和当归三种中药成分能够激活Smad信号,并且Smad1/5/8和Smad4形成共聚复合物,进入细胞核调控下游相关基因转录。碱性磷酸酶是骨形成代谢中重要的骨标志物,我们采用免疫荧光方法检测Mc3T3-E1细胞的碱性磷酸酶表达是否改变以及和Smad4信号情况。我们发现,空白对照组碱性磷酸酶信号较弱,Smad4信号集中在胞浆;三种中药给药组的碱性磷酸酶的表达增强,同时,Smad4向核内转位明显增强。这提示我们,中药成分活化碱性磷酸酶和Smad4信号通路。综上我们发现黄芪、西洋参和当归三种传统中药能够激活BMP4-Smad信号通路,并活化骨标志物碱性磷酸酶。利用生物信息学我们发现BMP4启动子上有多种甾体类激素受体的结合位点。为了揭示甾体类激素受体-BMP4信号通路的机制,我们采用了 RNA干涉和过表达方法探索和揭示各种甾体类激素受体通路对BMP4的作用。我们在HEK293T细胞中分别转染GR、AR、ER-α、ER-β,转染16h后,加入相关中药,作用24h后,采应用双荧光酶检测技术检测各组BMP4启动子活性。我们发现细胞中过表达AR扩大了黄芪对BMP4报告基因的激活效应,过表达ER-α扩大了黄芪、西洋参和当归三种中药对BMP4报告基因的激活效应。最后,我们采用基因干涉实验沉默相关甾体类激素受体。发现ER-α沉默逆转了黄芪、西洋参和当归三种中药对BMP4启动子的激活作用,而AR沉默逆转了黄芪对BMP4启动子的激活作用。提示我们,黄芪激活BMP4启动子是经由ER-α和AR实现的,西洋参和当归经ER-α激活BMP4启动子。以上结果表明,黄芪、西洋参和当归通过不同的甾体类激素受体信号通路活化BMP4启动子。本项研究证明,中药黄芪、西洋参和当归通过不同的甾体类激素受体信号上调BMP4基因的表达,从而激活前成骨细胞的BMP4-Smad信号转导通路,活化Smad1/5/8和Smad4分子进入细胞核,促进成骨标志物碱性磷酸酶的表达,从而调控骨形成和骨代谢。我们的研究提供了激活BMP4靶点的可能中药组分和信号通路,为骨缺损和骨质疏松症药物研发提供了依据。