背景冷冻肩(Frozen Shoulder)又称肩周炎,是以肩关节疼痛、各方向活动受限为特点的疾病,病程迁延,部分患者会长期遗留不同程度的疼痛及肩关节活动受限,严重影响生活质量。流行病学调查表明,冷冻肩发病年龄集中于30-70岁,平均约50岁,我国人群冷冻肩患病率高达5%;其中在糖尿病患者中的发病率高达10%-20%。冷冻肩患者合并糖尿病及高脂血症的患者占全部就诊冷冻肩患者的15%左右。随着人口老龄化的增加,冷冻肩严重威胁国人的身体健康和生活质量。冷冻肩目前病因不明,且在糖脂代谢紊乱患者中高发。研究表明,冷冻肩患者喙肱韧带和关节囊中存在大量的成纤维细胞,及大量的结节状的胶原纤维,因此提出冷冻肩的病理改变实质是纤维组织增生。同时,冷冻肩患者肩关节囊组织中成纤维细胞外胶原纤维束排列结构致密、混乱,而肩袖损伤患者肩关节囊组织中成纤维细胞外胶原纤维束排列稀疏、有序,且在冷冻肩患者代谢障碍的成纤维细胞外基质中,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、较肩袖损伤患者明显增高。已有研究表明,作为MMPs家族的一员,研究表明MMP-9与包括胶原蛋白在内的一系列的细胞外基质降解过程有关,并在病理过程为纤维化的疾病中起重要作用。同时,另有研究表明,MMP-9低表达易造成纤维化而引起大鼠盲肠手术后的腹膜粘连,MMP-9基因治疗可以通过减少纤维化而减少粘连。上述研究提示,MMP-9可能与冷冻肩病理过程中的组织纤维化相关。因此,从调控MMP-9相关的纤维化的角度出发,深入研究MMP-9与冷冻肩活动受限症状相关的信号转导通路,不但可以揭示冷冻肩发病相关分子过程,同时可为有效防治冷冻肩提供新的治疗靶点。研究表明,冷冻肩患者强化伸展运动后症状缓解,同时血浆中MMPs水平升高的同时,转化生长因子β(TGF-β)的表达水平显著降低。TGF-β作为一种促纤维化因子,在肺及其他组织纤维化的过程中起重要作用。而冷冻肩患者关节囊组织中TGF-β较正常人表达升高。提示TGF-β作为抑制基质降解的因素,可能与促进基质降解的MMP-9相互形成平衡,而两分子平衡紊乱即造成关节囊组织细胞外基质胶原蛋白降解的紊乱,使得成纤维细胞外胶原蛋白从稀疏、有序到致密、混乱,从而诱发组织纤维化,导致冷冻肩病理性纤维化的过程的发生。因此,从调控MMP-9及TGF-β平衡的角度出发,深入研究抑制冷冻肩纤维化的形成机制,由于TGF-β与MMP-9在纤维化病理变化中的变化相反,可以提示分子TGF-β与MMP-9的相对比例平衡紊乱最终导致细胞外基质中胶原代谢紊乱,引起冷冻肩发病,可为有效防治冷冻肩纤维化提供新的治疗靶点。并且,已有研究表明抑制TGF-β可延缓及减弱肺纤维化的过程[14],为相关靶点治疗冷冻肩纤维化的可能性提供依据。研究表明,PPAR-γ激动剂可以抑制TGF-β1所引起的胶原蛋白等细胞外基质表达上调,从而发挥其抗纤维化作用。同时,PPAR-γ激动剂可以抑制TGF-β诱导的的胶原生成,从而抑制肺纤维化。提示在纤维化的病理过程中,TGF-β可能处在PPAR-γ的下游位置,并且PPAR-γ激活不足可能诱导了TGF-β的升高,从而导致I型胶原表达升高,造成纤维化的发生。同时,由于PPAR-γ在调控能量代谢,特别是在糖及脂肪代谢中起重要作用,并可活化可调节多种控制葡萄糖及脂类代谢的相关基因的转录。由于冷冻肩高发与平均约50岁年龄,正处于糖脂代谢易紊乱期,提示可能局部或全身PPAR-γ活化不足,导致糖脂代谢紊乱,从而使得糖尿病患者更易患冷冻肩。最近研究表明,过表达PPAR-γ可以抑制大鼠的肝脏纤维化,提示PPAR-γ活化不足,可导致纤维化病理过程,负反馈调节介导PPAR通路相关因子表达增高,以利于PPAR-γ受体活化。当局部或全身PPAR-γ活化不足,导致糖脂代谢紊乱,同时由于丧失了TGF-β的抑制作用,促使TGF-β表达升高,从而导致MMP-9/TGF-β对细胞外基质中胶原蛋白的调控平衡被破坏,致使细胞外基质(胶原蛋白)代谢紊乱,造成胶原蛋白堆积,最终导致肩关节囊内纤维化的发生,引起冷冻肩活动受限及疼痛症状。当I型胶原蛋白表达升高后,负反馈调节介导PPAR通路被激活,相关因子表达增高,以利于PPAR-γ受体活化,从而抑制TGF-β的表达,利于MMP-9/TGF-β对细胞外基质中胶原蛋白的调控再次达到平衡,延缓纤维化的进程。同时,由于MMP-9能促进成纤维细胞基质分解代谢,推测PPAR-γ激活后,可以间接提高MMP-9的表达,利于MMP-9/TGF-β对细胞外基质中胶原蛋白的调控再次达到平衡,促进胶原蛋白代谢,因此,本项目将研究PPAR-γ激动剂是否通过影响MMP-9/TGF-β的表达调控成纤维细胞基质分解代谢。本论文从冷冻肩纤维化的角度,通过生物信息实验、细胞分子实验以及动物实验揭示PPAR信号通路及其负反馈调控机制在维持细胞外基质(胶原蛋白)生成降解平衡中的作用,有助于更深层次阐明冷冻肩的发病机理,从而为预防和治疗冷冻肩提供理论依据和新的思路,并为基于PPAR信号通路及MMP-9/TGF-β基因的药物设计提供有价值的生物学信息和结构基础,总结治疗冷冻肩的更多靶点,并最终为研发出可用于临床应用的药物提供理论基础。方法1.肩周炎患者肩关节囊中差异基因分析1)利用转录组学的方法,检测冷冻肩患者肩关节囊纤维化组织,与正常的肩关节关节囊组织转录水平的差异;2)寻找冷冻肩差异基因中与代谢相关的特异基因。2.研究人成纤维细胞中胶原蛋白/MMP-9/TGF-β的表达及其受PPAR-γ的影响1)检测TGF-β/MMP-9在人成纤维细胞中的表达,检测I型,II型,III型,IV型胶原蛋白在成纤维细胞及其细胞外基质中的;2)通过慢病毒感染的方式升高人成纤维细胞中TGF-β的表达,检测细胞外基质中胶原蛋白的变化情况,研究TGF-β对胶原蛋白表达的调控作用;3)通过慢病毒感染的方式升高人成纤维细胞中MMP-9的表达,检测细胞外基质中胶原蛋白的变化情况,研究MMP-9对胶原蛋白表达的调控作用;4)检测PPAR-γ在人成纤维细胞中的表达;5)通过使用激动剂CDDO-IM以及拮抗剂GW9662,激动及拮抗人成纤维细胞中PPAR-γ表达,检测成纤维细胞及外基质中TGF-β/MMP-9表达的变化情况,研究PPAR-γ对TGF-β/MMP-9表达的调控作用;6)通过使用激动剂CDDO-IM以及拮抗剂GW9662,激动及拮抗人成纤维细胞中PPAR-γ表达,检测成纤维细胞及外基质中胶原蛋白的变化,研究PPAR-γ对I型,II型,III型,IV型胶原蛋白代谢的调控作用;7)使用激动剂CDDO-IM以及拮抗剂GW9662,处理经过慢病毒感染过表达TGF-β的人成纤维细胞,以研究人成纤维细胞中PPAR-γ对于细胞外基质中I型,II型,III型,IV型胶原蛋白的影响,是否通过因TGF-β表达的改变而改变,进而研究PPAR-γ是否通过TGF-β发挥对于胶原蛋白的调控作用;8)使用激动剂CDDO-IM以及拮抗剂GW9662,处理经过慢病毒感染过表达MMP-9的人成纤维细胞,以研究人成纤维细胞中PPAR-γ对于细胞外基质中I型,II型,III型,IV型胶原蛋白的影响,是否通过因MMP-9表达的改变而改变,进而研究PPAR-γ是否通过MMP-9发挥对于胶原蛋白的调控作用;3.利用实验动物确认PPAR/TGF-β/MMP-9的相互影响方式及其在胶原蛋白代谢过程中的调节作用1)使用等同于人类40-50周岁年龄的新西兰兔,肩关节囊注射腺病毒/腺相关病毒过表达TGF-β以造成肩关节囊纤维化;2)检测TGF-β注射侧及非注射侧,新西兰兔麻醉状态下肩关节最大外展角度的回缩情况(活动度),了解TGF-β是否造成肩关节囊的挛缩;3)给予新西兰兔口服商品化PPAR-γ激动剂,检测TGF-β注射侧及非注射侧最大外展角度的回缩情况(活动度),以了解PPAR-γ激动剂对于肩关节囊的影响;4)检测TGF-β注射侧及非注射侧,以及口服商品化PPAR-γ激动剂后新西兰兔肩关节囊的HE组织切片染色情况,以了解肩关节囊的挛缩情况以及不同组别间的差别;4)使用免疫组化的方法检测TGF-β注射侧及非注射侧,以及口服商品化PPAR-γ激动剂后新西兰兔肩关节囊中TGF-β/MMP-9以及I型,II型,III型,IV型胶原蛋白的表达情况,以了解PPAR-γ激动剂在在体状态对于肩关节囊中不同蛋白的影响;5)使用Western-Blot方法检测TGF-β注射侧及非注射侧,以及口服商品化PPAR-γ激动剂后新西兰兔肩关节囊中TGF-β/MMP-9以及I型,II型,III型,IV型胶原蛋白的表达情况,以了解PPAR-γ激动剂在在体状态对于肩关节囊中不同蛋白的影响。结果1.肩周炎患者差异基因主要表现在PPAR信号通路1)试验结果表明,在软骨细胞的体外培养中,刺激TGF-β可以明显提高细胞外基质中I型胶原蛋白的表达,除此之外,本研究还发现,TGF-β的刺激,可以明显抑制软骨细胞PPAR-γ的表达。2)通过对9位冷冻肩患者及5位肩锁关节脱位患者的肩关节囊组织的m RNA进行转录组分析,进行对比后发现,冷冻肩患者与肩锁关节脱位患者的关节囊组织m RNA作对比,相关生物学过程的富集结果显示,差异基因与应答有关。3)冷冻肩患者与肩锁关节脱位患者的关节囊组织m RNA作对比,其分子功能富集结果显示,差异基因主要表达蛋白结合(特别在结合珠蛋白)等分子功能上。4)冷冻肩患者的关节囊组织m RNA与肩锁关节脱位患者作对比,信号通路富集结果显示,其差异基因主要体现表现在PPAR信号通路。5)根据蛋白之间的相互作用所绘制的图形化网络,显示冷冻肩患者关节囊组织中,MMP-9基因低表达,而PPAR信号通路中有多个基因表达增高。2.人成纤维细胞中胶原蛋白/MMP-9/TGF-β的表达受PPAR-γ的影响1)人成纤维细胞感染TGF-β及MMP-9慢病毒载体48小时后见绿色荧光标记,而对照组不发光,空载病毒亦见绿色荧光标记,提示成纤维细胞感染TGF-β及MMP-9成功。2)实验显示,在HFF细胞中,GW9662在40 u/ul可以得到较明显的抑制效果,CDDO-IM在20 u/ul可以得到较明显的过表达效果。在HSF细胞中,GW9662在40 u/ul可以得到较明显的抑制效果,CDDO-IM在20 u/ul可以得到较明显的过表达效果,且HSF细胞中GW9662的抑制效果较明显。3)实时定量PCR结果显示,与对照组相比,可得到如下结果:(1.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制PPAR-γ在人成纤维细胞中的转录;PPAR-γ激动剂CDDO-IM可以升高PPAR-γ在人成纤维细胞中的转录;(1.2)使用PPAR-γ拮抗剂GW9662抑制过表达TGF-β以及MMP-9后的人成纤维细胞,差异不具有统计学意义;(1.3)使用PPAR-γ激动剂CDDO-IM激动过表达TGF-β以及MMP-9后的人成纤维细胞,差异具有统计学意义;(1.4)过表达TGF-β可引起PPAR-γ在人成纤维细胞中的转录水平升高;(1.5)过表达MMP-9无法引起PPAR-γ在人成纤维细胞中的转录水平升高;(2.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制TGF-β在人成纤维细胞中的转录;PPAR-γ激动剂CDDO-IM可以升高TGF-β在人成纤维细胞中的转录;(2.2)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达TGF-β引起的TGF-β转录增高;(2.3)过表达MMP-9可引起TGF-β在人成纤维细胞中的转录水平升高;且该转录增高可被PPAR-γ拮抗剂GW9662所抑制;(3.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制MMP-9在人成纤维细胞中的转录;PPAR-γ激动剂CDDO-IM可以升高MMP-9在人成纤维细胞中的转录;(3.2)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达MMP-9所引起的MMP-9转录增高;(4.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制II,III,IV型胶原蛋白在人成纤维细胞中的转录;PPAR-γ激动剂CDDO-IM可以升高III,IV型胶原蛋白在人成纤维细胞中的转录;(4.2)过表达TGF-β可以升高I,II,III,IV四种胶原蛋白在人成纤维细胞中的转录;(4.3)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达TGF-β所引起的I,II,III,IV四种胶原蛋白在人成纤维细胞中的转录增高;(4.4)过表达MMP-9可以升高IV型胶原蛋白的转录;(4.5)人成纤维细胞过表达MMP-9后,PPAR-γ拮抗剂GW9662以及激动剂CDDO-IM均可导致I,II,IV型胶原蛋白的转录升高;但对于III型胶原蛋白的作用相反。4)Western-blot实验结果显示,与对照组相比,可得到如下结果:(1.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制PPAR-γ在人成纤维细胞中的表达;PPAR-γ激动剂CDDO-IM可以升高PPAR-γ在人成纤维细胞中的表达;(1.2)使用PPAR-γ拮抗剂GW9662抑制过表达TGF-β以及MMP-9后的人成纤维细胞,其PPAR-γ表达差异不具有统计学意义;(1.3)使用PPAR-γ激动剂CDDO-IM激动过表达TGF-β以及MMP-9后的人成纤维细胞,其PPAR-γ表达差异具有统计学意义;(1.4)过表达TGF-β及MMP-9均可引起PPAR-γ在人成纤维细胞中的表达升高;(2.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制TGF-β在人成纤维细胞中的表达;PPAR-γ激动剂CDDO-IM改变TGF-β在人成纤维细胞中的表达,差异不具有统计学意义;(2.2)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达TGF-β引起的TGF-β表达增高;但不可抑制过表达MMP-9引起的TGF-β表达增高;(2.3)过表达MMP-9亦可引起TGF-β在人成纤维细胞中的表达水平升高;(3.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662及激动剂CDDO-IM,影响MMP-9在人成纤维细胞中的表达,差异不具有统计学意义;(3.2)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达MMP-9所引起的MMP-9表达增高;(3.2)PPAR-γ激动剂CDDO-IM,可以引起过表达TGF-β及MMP-9后的人成纤维细胞MMP-9表达增高;(4.1)PPAR-γ拮抗剂GW9662,仅可以抑制I型胶原蛋白在人成纤维细胞中的表达;且PPAR-γ激动剂CDDO-IM仅可升高I型胶原蛋白的表达;(4.2)过表达TGF-β可以升高I,II,IV型胶原蛋白在人成纤维细胞中的表达;(4.3)PPAR-γ拮抗剂GW9662,可以抑制过表达TGF-β所引起的I,II,III,IV四种胶原蛋白在人成纤维细胞中的表达增高;(4.4)过表达MMP-9可以升高I型胶原蛋白的表达;(4.5)人成纤维细胞过表达MMP-9后,PPAR-γ拮抗剂GW9662以及激动剂CDDO-IM均可导致I,II,IV型胶原蛋白的表达升高;但对于III型胶原蛋白的作用相反。3.动物实验中TGF-β对PPAR-γ通路的激活及胶原蛋白代谢具有调节作用1)术后4周,检测不同组别实验动物血浆中的罗格列酮血药浓度,血药浓度在有效范围内,确定口服药品在实验动物体内的有效性;2)术后4周,病理切片结果可以观察到,较对照组及单纯喂药组相比,TGF-β过表达组中肩关节囊内胶原蛋白形成的纤维束排列方向稍紊乱,且胶原蛋白密度增大堆积成团,并且在切片中出现强嗜酸性的深粉红色深染区域,而TGF-β过表达+喂药组中肩关节囊,较TGF-β过表达组关节囊内的胶原蛋白纤维束排列并无明显差异,并且胶原蛋白依旧密度增大堆积成团,且出现强嗜酸性。3)动物实验免疫组化结果显示:1)罗格列酮口服给药4周,未见实验动物肩关节囊中的PPAR-γ表达;罗格列酮口服给药4周,未见实验动物肩关节囊中的TGF-β表达受抑制;2)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的TGF-β表达升高;3)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的PPAR-γ表达升高;4)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β后,未见实验动物肩关节囊中的MMP-9表达升高;4)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的I型及III型胶原蛋白表达升高;5)罗格列酮口服给药4周(未见PPAR-γ高表达),与对照组相比,未见实验动物肩关节囊中的I,II,III,IV型胶原蛋白的表达改变;亦未见对过表达TGF-β引起的的I型及III型胶原蛋白表达升高有改变。4)动物实验WB结果显示:1)罗格列酮口服给药4周,未见实验动物肩关节囊中的PPAR-γ表达;罗格列酮口服给药4周,未见实验动物肩关节囊中的TGF-β表达收到抑制;2)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的TGF-β表达升高;3)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的PPAR-γ表达升高;4)实验动物肩关节囊内注射腺相关病毒载体过表达TGF-β可以使实验动物肩关节囊中的I型及III型胶原蛋白表达升高;5)罗格列酮口服给药4周(未见PPAR-γ高表达),未见实验动物肩关节囊中的I,II,III,IV型胶原蛋白的表达改变;亦未见过表达TGF-β引起的的I型及III型胶原蛋白表达升高有改变。