【摘 要】
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目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子(RI)基因的重组腺相关病毒,转染人膀胱癌细胞T24,并检测其对人膀胱癌T24细胞侵袭和转移的影响。方法Trizol法提取人脐静脉内皮细胞总RN
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目的构建携带全长人核糖核酸酶抑制因子(RI)基因的重组腺相关病毒,转染人膀胱癌细胞T24,并检测其对人膀胱癌T24细胞侵袭和转移的影响。方法Trizol法提取人脐静脉内皮细胞总RNA,经RT-PCR扩增RI基因,克隆至pUCm-T质粒中,再亚克隆至pAAV-IRES-hrGFP载体,构建pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒,并协同pAAV-RC和pAAV-Helper质粒共转染HEK-293细胞,包装并扩增腺相关病毒RI-AAV,检测其滴度,并转染T24细胞,分别用RT-PCR和Western blot检测RI基因的表达水平。观察细胞形态改变,细胞粘附实验,划痕实验和Transwell法测定细胞黏附、迁移和侵袭能力的变化,及用激光共聚焦显微镜观察细胞骨架微丝结构。结果经双酶切及测序鉴定pAAV-IRES-hrGFP-RI重组质粒构建正确;荧光观察显示HEK-293细胞转染成功,RI-AAV病毒滴度为1.1×1010U/ml;RI-AAV转染组的mRNA及蛋白表达水平较未转染组及空病毒对照组均有提高,且差异有统计学意义。细胞黏附显著增强,迁移和侵袭能力显著降低,细胞骨架微丝散乱,细胞无片状伪足或消失。结论已成功构建重组人RI腺相关病毒,过表达RI基因的表达后引起膀胱癌细胞的一系列特性改变,显著降低膀胱癌细胞迁移和侵袭能力。结合之前的研究,上调RI表达能抑制肿瘤在体内转移和侵袭,说明重组RI腺相关病毒有望可应用于临床,治疗膀胱癌。
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