论文部分内容阅读
随着蔬菜设施栽培的发展，土壤次生盐渍化日益突出，已严重影响到设施栽培的经济效益。利用植物对盐害耐性的差异，充分挖掘植物适应盐害的潜力，提高蔬菜的耐盐能力是次生盐害防治的途径之一。番茄是耐盐性中等的蔬菜，也是设施栽培的主要蔬菜品种，通过基因工程提高番茄的耐盐性不仅具有重要的现实意义，也具有实际可行性。 HAL1基因最早是从啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中分离的可能与K~+离子吸收、转运调节有关的基因。已有的转基因植物耐盐检测表明，转HAL1基因植株的耐盐性得到不同程度的提高，但HAL1基因的确切功能有待进一步研究证实。 本研究通过农杆菌介导把HAL1转入番茄栽培品种早粉8号，分子检测得到转基因植株。研究了外源HAL1基因对番茄耐盐性的影响，探讨了转HAL1基因番茄的耐盐机理和HAL1基因的可能功能。 主要结果如下： (1)以番茄子叶和下胚轴为外植体，以愈伤组织诱导、不定芽分化及植株再生情况为指标，研究得出番茄早粉8号基因转化的受体系统为：外植体为子叶，培养基为BA2.0mg／L+IAA0.2mg／L+MS基本培养基。 (2)以外植体的生长，农杆菌的增殖，不定芽的分化和成苗为指标，筛选出了合适的转化条件，建立了高效的农杆菌介导的番茄遗传转化系统。分别为农杆菌稀释10倍，浸染5分钟，共培养2天。 (3)通过农杆菌介导把HAL1基因转入番茄栽培品种早粉8号，PCR和Southern Blot检测得到转基因植株，转化率达到4.5％。转基因植株经繁殖得到了T1代转基因番茄种子。 (4)转基因植株Southern杂交显示出单一的杂交带，表明外源HAL1基因在番茄染色体上的整合为单拷贝插入。卡那霉素抗性检测表明，T1代转基因种子抗性与非抗性比例为3.29：1，基本符合3：1的孟德尔遗传分离方式，也表明外源基因在番茄染色体上为单位点插入。而且外源HAL1基因已遗传到后代。 (5)用T1代转基因种子在盐胁迫下进行发芽实验，在无NaC胁迫下，对照种子和转基因种子的发芽率为87-89％。在50、100、150、200mM的NaC1胁迫下，转基因种子的发芽率分别为76％，59％，43％、6％。而对照种子在100mM的NaC1胁迫下发芽率只有 11刀％，在 150 mM的 NaCI胁迫下的发芽率为零。转基因种子的发芽指数也得到提高，表明盐胁迫对转基因番茄发芽的延迟作用降低，一般比对照提早出芽12天。因此，转HALI基因显著提高了番茄苗期的耐盐性。 u）从盐胁迫下细胞膜透性、根冠比和叶绿素含量的变化来看，转基因番茄的电解质相对外渗率小于对照，细胞膜稳定性好，根冠比和叶绿素含量大于对照，表明NaCI胁迫对转基因番茄细胞的伤害小，对根系和叶片的生长抑制作用要小于对照。进一步证实了转HALI基因番茄的耐盐性得到提高。 （7）转基因番茄在盐胁迫 3天后液泡膜和质膜 H－ATPase活性比对照有明显提高，这有利于根系对K’的选择吸收和运输，降低Na”的吸收，促进根细胞中的Na’在液泡中积累，减少根细胞质中的Na’向地上部运输，提高K’／Na”。 沾）从盐胁迫下地上部，地下部 K”，Na”的积累特点看，相比对照，转基因番茄根系、茎杆和叶片的K‘／Na‘都得到提高。而转基因植株Na“的净累积速率比对照的Na“的净累积速率低，可把吸收的Na“尽量多的分配在根系，而把吸收的K’更多的累积在地上部，保持了地上部较高的的K’／Na’。同时，转基因根系的S。地增大，叶的RSM。减小，说明其对K‘／Na”离子的选择吸收和运输能力加强。不但选择吸收K‘Ma‘，而且表现出整株水平上的有利于耐盐的 K“／Na”区域化分配。因此，转 HAL 基因番茄的耐盐机理在于根系对K’、Na”的选择吸收，和 K”、Na‘在根、茎、叶等整株水平上的区域化分配。 （9）在无 NaCI胁迫时，不但转基因番茄的生长及产量与对照无明显差异，而且转基因番茄的表型如叶片形状、颜色，开花节位等没有变化。说明外源耐盐基因的转入对番茄其他性状无明显影响。 （10）转基因番茄的不同生育期的耐盐性实验表明，盐胁迫不同程度抑制了番茄的生长发育，降低了产量。但相比对照，转基因番茄的生长和产量都得到了提高。对照番茄 100mMNaCI 时已表现出明显的盐害症状，产量比正常产量降低 40．5％。1501llMNICI时，产量只有正常产量的9．9％。到200 IMNICI时，植株完全死亡。而转基因番茄在 150 n1MNaC！时无黄化叶片，产量是对照的 5．8倍，是无盐胁迫产量的 59．4％。在200InMNaCI胁迫下产量仍达到无盐胁迫产量的23．4％。说明盐胁迫对苗期番茄的生长抑制作用十分明显，苗期是番茄盐害的敏感期。同时也表明转基因番茄不同时期的耐盐性得到了提高。预示了HALI基因在蔬菜耐盐育种上的巨大潜力。 （11）HALI基因的功能可能是增强 K’Ma”的选择吸收，降低细胞 Na‘的毒害，调节细胞K‘／Na十b例，从而实现在细胞水平和整株水平的有利于耐盐的区域化分配。