二甲双胍是一种双胍类化合物,因其治疗2型糖尿病的疗效高且副作用小而被广泛应用。近年来,它作为一种潜在的癌症化学预防或治疗药物引起了人们极大的兴趣。二甲双胍是线粒体复合物I的抑制剂,可直接诱导癌细胞线粒体功能障碍并激活能量传感器AMPK,活化的AMPK提高细胞内NAD+的浓度并激活SIRT1从而调控下游靶标（如NF-κB和Fox Os）,参与多种生理过程,例如细胞死亡（主要包括凋亡和自噬依赖性坏死）、增殖、迁移和衰老。凋亡和自噬依赖性坏死途径的缺失会激活新的程序性细胞死亡途径,即细胞焦亡。最初是由炎性caspases（caspase1/4/5/11）裂解gasdermin D（GSDMD）,产生坏死性N末端片段并在质膜上形成有活性的跨膜孔,释放炎性因子,破坏渗透压,导致细胞膨胀、质膜上生出大气泡,诱导了细胞焦亡。NF-κB通过激活GSDMD诱导小鼠小肠上皮细胞和脂肪组织细胞的焦亡,引起全身性炎症反应。2017年,邵峰等人首次发现当用某些外界刺激物（如化疗药）处理癌细胞时,gasdermin家族成员E（GSDME）被caspase3特异性切割,释放其活性N末端片段,最终诱导癌细胞焦亡。2018年又有人提出,在表达GSDME的癌细胞中,Bax的聚集、细胞色素c从线粒体释放到胞质中以及caspase3的活化等线粒体凋亡途径的激活,可通过裂解GSDME诱导细胞焦亡。因此我们猜测:二甲双胍通过AMPK/SIRT1促进NF-κB对caspase3/GSDME的活化并通过诱导线粒体功能障碍驱动癌细胞焦亡。在本部分中,我们使用人癌细胞系Hep G2、MCF-7、HCT-15和HT-29探讨二甲双胍是否诱导癌细胞发生焦亡。MTT实验结果显示,二甲双胍以时间依赖性的方式（2、4、8、12、16和24 h）抑制癌细胞增殖;通过显微镜观察我们发现20 m M二甲双胍处理Hep G2细胞4、8和12 h后,细胞出现典型的细胞焦亡形态,即细胞发生肿胀以及细胞质膜上吹出特征性的大气泡。乳酸脱氢酶（LDH）的释放可作为焦亡的细胞毒性指标,二甲双胍处理Hep G2、HCT-15和HT-29细胞4、8和12 h后,我们检测到LDH的释放增强;通过免疫印记（Western blot）实验进一步检测了焦亡相关蛋白（cleaved-caspase3和GSDME-N）的表达水平。结果显示,二甲双胍显著上调了它们的蛋白水平。上述实验结果证明二甲双胍诱导了肝癌、乳腺癌和结肠癌细胞的焦亡。之后我们对二甲双胍诱导癌细胞焦亡的分子机制进行探讨。Western blot结果显示,二甲双胍处理Hep G2和MCF-7细胞2、4、8和12h后,显著增加了p-AMPK和SIRT1的表达,并上调SIRT1下游的NF-κB p65、Bax和细胞色素c的蛋白水平,促进caspase3和GSDME的裂解。为了探究SIRT1和NF-κB在二甲双胍诱导癌细胞焦亡中的作用,我们使用SIRT1抑制剂EX527和小干扰RNA（si RNA）沉默Hep G2和MCF-7细胞中的SIRT1,结果发现抑制SIRT1后逆转了二甲双胍引起的NF-κB p65、Bax、细胞色素c和焦亡相关蛋白表达的上调,表明二甲双胍通过激活SIRT1及其下游靶标诱导癌细胞焦亡。当我们在Hep G2和MCF-7细胞中加入NF-κB抑制剂BAY11-7082后,NF-κB p65的表达被抑制,二甲双胍上调的Bax、cleaved-caspase3和GSDME-N的表达随之受到抑制,以上实验结果说明二甲双胍通过激活AMPK/SIRT1促进NF-κB对caspase3/GSDME的活化,诱导癌细胞焦亡。由于二甲双胍能够诱导线粒体损伤,在本文中,我们探究二甲双胍能否通过诱导线粒体损伤促进癌细胞焦亡,结果发现,二甲双胍处理后,癌细胞线粒体膜电位降低,ROS水平上调,线粒体生物合成蛋白PGC-1α的表达受到抑制。当我们使用诱导线粒体损伤的氧化磷酸化解偶联剂CCCP处理Hep G2和MCF-7细胞后,PGC-1α的蛋白表达降低,cleaved-caspase3和GSDME-N的表达水平显著提高,说明二甲双胍通过诱导癌细胞线粒体损伤促进癌细胞焦亡的发生。CCCP处理Hep G2和MCF-7细胞后,也增强了二甲双胍上调的SIRT1、Bax、细胞色素c和焦亡相关蛋白的表达,而AMPK抑制剂Compound C（CC）处理并没有改变二甲双胍降低的线粒体膜电位,提示二甲双胍通过诱导线粒体损伤促进AMPK/SIRT1途径介导的细胞焦亡。以上结果说明,二甲双胍通过激活AMPK/SIRT1信号通路促进NF-κB p65的表达,上调Bax和细胞色素c的蛋白水平,最终激活癌细胞中焦亡相关蛋白caspase3和GSDME,诱导细胞焦亡。SIRT1在细胞核和细胞质中均表达,其亚细胞定位影响它在癌症中的作用。我们前面的实验结果已经证明了二甲双胍激活AMPK/SIRT1通路,但二甲双胍通过调节癌细胞核质中SIRT1的酶活性发挥抗癌作用的机制尚未见报道。这里我们用不同浓度的二甲双胍（5、10、15、20和25 m M）分别处理MCF-7、MDA-MB-231、H1299和A549癌细胞24 h,MTT实验结果显示,二甲双胍以浓度依赖性的方式降低细胞活力,抑制癌细胞增殖。我们继续进行Hoechst-PI核荧光染色实验,发现二甲双胍提高了癌细胞的凋亡率;同时,二甲双胍处理MCF-7和MDA-MB-231细胞24 h后上调了cleaved-caspase3的蛋白水平来诱导癌细胞凋亡。我们还研究二甲双胍对上皮间充质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition,EMT）以及癌细胞迁移的影响,发现二甲双胍上调了上皮标志物E-cadherin的表达,下调间充质标志物N-cadherin、β-catenin和Vimentin的蛋白水平,并抑制了癌细胞的迁移。我们进一步探究二甲双胍诱导癌细胞凋亡、抑制细胞迁移的机制,实验结果显示,20 m M二甲双胍处理乳腺癌和肺癌细胞24 h后,增加了AMPK的表达并降低NADH水平,增强了总的SIRT1酶活性。当用AMPK抑制剂CC处理癌细胞后,NADH水平增加,SIRT1酶活性受到抑制,说明二甲双胍通过激活AMPK上调SIRT1的酶活性。为了探究二甲双胍对癌细胞核质中SIRT1酶活性的影响,分离MCF-7和MDA-MB-231细胞中的核质蛋白后,进行SIRT1酶活性荧光检测,发现二甲双胍降低了细胞核中的SIRT1酶活性,增加了细胞质中的SIRT1酶活性;而CC处理上调了细胞核中的SIRT1酶活性,抑制细胞质中的SIRT1酶活性。为了验证SIRT1在癌细胞凋亡和迁移中的作用,我们使用si RNA沉默MCF-7细胞中的SIRT1,发现敲低SIRT1增加了癌细胞的凋亡率和迁移率。这些结果表明二甲双胍通过激活AMPK下调细胞核中SIRT1酶活性并上调细胞质中SIRT1酶活性,从而诱导癌细胞凋亡并抑制细胞迁移。有研究提出在非小细胞肺癌（Non-small-cell carcinoma,NSCLC）中,肿瘤抑制基因DLC1在细胞核中诱导凋亡,在细胞质中抑制迁移,具体机制还不完全清楚。我们实验室之前的研究证明,白藜芦醇通过上调贡氏假鳃鳉肝脏中SIRT1和DLC1的蛋白水平促进肿瘤细胞的凋亡。在本文中,我们发现,二甲双胍上调了MCF-7和H1299细胞中总的DLC1蛋白水平。将细胞核质蛋白分离后,发现二甲双胍分别促进细胞核和细胞质中DLC1的表达,且核中上调水平大于质中,升高了DLC1的核/质比率,说明二甲双胍增强癌细胞中DLC1表达的同时也促进其入核。在MCF-7细胞中过表达DLC1后,细胞凋亡标志物cleaved-caspase3/9的蛋白水平上调,同时,上皮标志物（claudin-1）的表达升高,间充质标志物（N-cadherin、β-catenin、Vimentin和Snail）的蛋白水平降低,且癌细胞的迁移受到抑制。为了研究SIRT1对DLC1的调节作用,我们在MCF-7细胞中敲低SIRT1,发现总的DLC1蛋白水平上调;SIRT1抑制剂EX527处理MCF-7和H1299细胞后,结果显示,DLC1在细胞核中的表达显著增强。这些结果表明DLC1是SIRT1的下游靶标,SIRT1负向调节细胞核中DLC1的表达。据报道在胃癌细胞中,组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA通过调节DLC1启动子上组蛋白的乙酰化水平促进其m RNA的表达,SIRT1作为一种组蛋白去乙酰化酶,或许它能调控DLC1的启动子。另外,磷酸激酶C（PKC）磷酸化DLC1后降低其与14-3-3的相互作用,从而阻止它入核而不能发挥抗癌活性。为了探究二甲双胍如何通过SIRT1调控DLC1的表达,我们进行半定量PCR实验,发现二甲双胍和SIRT1抑制剂EX527均上调了DLC1的m RNA水平。Ch IP实验结果进一步确定了SIRT1结合的DLC1启动子片段的存在,二甲双胍处理后降低了这种结合,进而促进核中DLC1的表达;同时,二甲双胍显著降低PKC和14-3-3的表达,并抑制了DLC1与14-3-3蛋白的相互作用,促进DLC1的核定位。除了PKC,DLC1还被蛋白激酶B（AKT）磷酸化,降低了它本身的肿瘤抑制活性,减弱对癌细胞生长和迁移的抑制。我们之前的结果证明SIRT1的激活剂白藜芦醇通过调节AKT对DLC1的磷酸化水平,抑制肝细胞癌的生长。接下来探究二甲双胍是否通过SIRT1调节DLC1的翻译后修饰抑制癌细胞的迁移。Co-IP实验结果显示,二甲双胍促进SIRT1与DLC1的相互作用,下调了DLC1的乙酰化水平。二甲双胍还降低了有活性的AKT（p-AKT）的表达,并抑制PAS（即AKT对DLC1的磷酸化）水平;在MCF-7细胞中使用si RNA敲低SIRT1或EX527处理进一步探究SIRT1在二甲双胍调节DLC1磷酸化中的作用,发现SIRT1抑制后,不仅上调了DLC1的乙酰化水平,也增加AKT对DLC1的磷酸化水平,提示二甲双胍通过促进SIRT1对DLC1的去乙酰化抑制AKT介导DLC1的磷酸化,增强DLC1抗癌活性。综上所述,我们发现二甲双胍通过调节SIRT1在细胞核质中的酶活性促进DLC1对癌细胞凋亡的诱导和迁移的抑制。FoxO3a是SIRT1重要的下游靶标,被SIRT1去乙酰化后发挥抗癌作用。也有研究显示FoxO3a可被AKT磷酸化,降低其与14-3-3蛋白的相互作用,进而阻止FoxO3a入核抑制癌细胞增殖。本文中我们探究二甲双胍如何调节SIRT1对FoxO3a的翻译后修饰抑制癌细胞的增殖。二甲双胍处理MCF-7、MDA-MB-231、H1299和A549四种癌细胞后检测总的FoxO3a的表达,结果显示,二甲双胍上调了它的蛋白水平;分离MCF-7和H1299癌细胞的核质蛋白后进行western blot分析,我们发现二甲双胍既增加了细胞核中FoxO3a的表达,也提高了FoxO3a的核/质比率,说明二甲双胍诱导了FoxO3a的入核。Western blot和Co-IP实验结果显示,二甲双胍降低p-AKT和14-3-3蛋白水平,抑制FoxO3a的磷酸化水平,阻碍了FoxO3a与14-3-3的相互作用。为了证明SIRT1在二甲双胍调节FoxO3a翻译后修饰中的作用,我们进行了Co-IP实验,发现二甲双胍增强SIRT1和FoxO3a的相互作用,降低FoxO3a的乙酰化水平,而SIRT1敲低或EX527处理上调FoxO3a的乙酰化水平后,FoxO3a的磷酸化水平及其与14-3-3的相互作用增强。这些结果说明二甲双胍通过增强SIRT1对FoxO3a的去乙酰化抑制AKT介导的磷酸化,促进FoxO3a入核。由于入核活化的FoxO3a参与癌细胞的增殖抑制,我们检测细胞增殖标志物PCNA的表达,发现二甲双胍降低PCNA的蛋白水平。以上结果说明二甲双胍通过SIRT1调节FoxO3a的翻译后修饰,促进其入核以抑制癌细胞增殖。最后,我们利用鸡胚尿囊膜（CAM）移植瘤模型检测二甲双胍对体内实体瘤生长的影响。结果显示,二甲双胍处理组中MCF-7和A549细胞形成的肿瘤体积更小。为了进一步研究二甲双胍抑制体内肿瘤生长的机制,对CAM上形成的肿瘤块进行冰冻切片的制备和免疫组织化学的染色。结果显示,二甲双胍增加了肿瘤组织中DLC1和cleaved-caspase3的蛋白水平,降低了EMT指标β-catenin的表达。同时,二甲双胍促进肿瘤中FoxO3a的表达,抑制细胞增殖标志物PCNA的蛋白水平。这些结果表明二甲双胍在体内通过促进DLC1和FoxO3a的表达而抑制肿瘤的生长。以上结果显示,二甲双胍以AMPK依赖的方式降低细胞核中SIRT1酶活性并增强细胞质中SIRT1酶活性,诱导癌细胞凋亡以及抑制癌细胞迁移。在细胞核中,二甲双胍通过抑制SIRT1与DLC1启动子的结合提高DLC1 m RNA和蛋白的表达水平,并通过抑制PKC通路促进DLC1的核定位,最终诱导caspases介导的细胞凋亡。在细胞质中,二甲双胍增强SIRT1对DLC1和FoxO3a的去乙酰化水平并抑制AKT对它们的磷酸化调控,促进DLC1对EMT相关的细胞迁移的抑制以及FoxO3a对癌细胞增殖的抑制。本章报道了二甲双胍通过调节SIRT1在细胞核质中的酶活性促进DLC1和FoxO3a的抗癌作用。