小黄鱼17β-雌二醇浸浴及光照、声音应激刺激的影响研究

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小黄鱼(Larimichthys polyactis)是我国重要的海洋经济鱼类之一,目前小黄鱼的全人工繁育已取得成功,人工养殖发现,雌鱼体形大于雄鱼,全雌化养殖具有更高的经济效益;同时小黄鱼也表现出应激反应较强的现象,导致个体较易受伤或死亡。本研究选择不同浓度的17β-雌二醇(17β-estradiol,E2)对小黄鱼幼鱼进行浸浴处理;以及对应激反应系统中交感—嗜铬组织系统的产物肾上腺激素合成步骤的关键酶多巴胺-β-羟化酶(dopamine-beta-hydroxylase,DBH)和苯乙胺-N-甲基转移酶(phenylethanolamine N-methyl transferase,PNMT)基因进行生物信息学分析,并对小黄鱼在声音、光照的应激处理下,对小黄鱼dbh和pnmt基因在脑和肾的表达情况进行研究。本研究的主要结果包括:1.在20-60dat(处理后天数,days after treatment)时,E2浸浴实验组在体长和体重上均显著低于对照组,60dat时,GSI(Gonadosomatic index)水平E2浸浴实验组和雌性对照组C(0)相比无显著性差异。解剖学及组织观察学表明,E2浸浴实验组1μg/L与10μg/L性腺头端粗短,出现二时相至三时相卵母细胞,且有明显卵巢腔,50μg/L组部分性腺发育畸形。当E2浓度达到10μg/L以上时,未发现雄性及未分化性腺,且随着浓度的上升,出现畸形的比率上升。E2浸浴组雌性率分别82%,88%,63%,对照组性比近似1:1。2.从小黄鱼全基因组中通过拼接及鉴定,确定出1个dbh和2个pnmt基因(pnmt a,pnmt b),dbh基因包含12个外显子,全长10865bp(碱基),编码区共1859bp,蛋白序列共605aa(氨基酸),pnmt a包含3个外显子,pnmt a基因全长2056bp,编码区共822bp,共翻译273aa,pnmt b包含3个外显子,pnmt b基因全长2908bp,编码区共543bp,共翻译180aa,氨基酸序列与鱼类相比,同源性大于65%,通过进化树的构建,发现大黄鱼(Larimichthys crocea)与其的亲缘关系最为接近。从转录组数据中得知,dbh基因在肠、脑、肾、头肾、精巢组织中表达,在皮肤、腮、眼、卵巢、脾组织中微量表达。pnmt a基因在脑、肾和头肾组织中高量表达,在肠、皮肤、脑、腮、精巢中微量表达,pnmt b在肠、皮肤、腮、脑、肾、头肾、精巢中表达和在肝、眼、心、脾中微量表达。3.通过检测pnmt a、pnmt b和dbh在不同时间15s、90s和300s刺激下脑与肾脏组织中的表达情况,结果表明在光照刺激脑组织中,300s组pnmt a和dbh基因表达量在实验同组中表达最高,90s组pnmt b基因的表达量在实验同组中表达量最高。在肾组织中,300s组的pnmt a、b和dbh基因表达量在实验同组中表达最高。在声音刺激的脑组织中,300s组的pnmt a、b和dbh基因表达量在实验同组中表达最高,在肾组织中,15s组pnmt a基因表达量在同组中最高,300s组pnmt b、dbh基因表达量在同组中最高。光照和声音的刺激,激发了小黄鱼“交感-嗜铬组织”系统,可以导致小黄鱼dbh和pnmta、b基因的表达上调,且随着时间的延长,表达量会升高。本研究用不同浓度雌激素E2诱导小黄鱼幼鱼,当E2浓度为10μg/L时,诱导效果最好,主要表现在雌性率最高,为研究小黄鱼性别分化的机制以及全雌化育种的可能奠定理论基础。对小黄鱼dbh和pnmt基因进行生物信息学分析,发现dbh和pnmt基因和大黄鱼的亲缘关系最近,pnmt基因可能存在一个复制基因;在声音、光照的应激处理下,发现小黄鱼dbh和pnmt基因在脑和肾组织中的基因表达均会上调,为进一步研究鱼类的应激反应机制奠定了基础。
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