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目的:观察独活香豆素对乳胞素(Lactacystin)诱导的帕金森病模型细胞活性以及细胞上清液中炎症因子hs-CRP、MMP-9的影响,探讨独活香豆素对帕金森病模型细胞进行保护的机制,为临床应用独活治疗帕金森病提供实验与理论支撑。材料与方法:1.含药血清制备:大鼠随机分为四组,正常组、吐温组、塞来昔布组、独活香豆素组。各组大鼠给药剂量公式为成人临床剂量乘以0.018,独活香豆素组依据前期实验研究得出给药剂量为常规剂量的3倍。除正常组20只/组,其余10只/组。各组给药浓度分别为:正常组:生理盐水;吐温组:浓度为0.08%吐温80;塞来昔布组:20mg/kg;独活香豆素组:155mg/kg(吐温80助溶)。每日上午灌胃给药一次,2ml/次/只,连续给药7天。第7天给药后取血并分离出上清液。灭活除菌后,于-20℃冰箱中冷冻备用。2.神经元样PC12细胞分化与培养:取对数生长期的PC12细胞,加入神经生长因子NGF(终浓度为50ng/ml)诱导分化为神经元样PC12细胞。分化完全后,将更换培养基为含15%马血清的细胞培养基,以1×106/ml密度,100μl体系,接种入96孔板内,备用。3.确定Lactacystin作用浓度:取对数生长期的神经元样PC12细胞,用15%马血清作为细胞培养基,37℃,5%CO2箱内培养细胞24小时,待其贴壁后,分组加入稀释好的Lactacystin,作用24h,MTT法检测细胞存活率,筛选出造模药浓度。4.确定含药血清浓度及作用时间:取对数生长期神经元样PC12细胞,共分为16组,分别为空白对照组(马血清),以及分别为10%、15%、20%三个浓度的正常对照组、模型组、吐温组、塞来昔布组、独活香豆素组。按上述分组预保护24h、48h,除空白对照组和各正常对照组外,其余12组分别加入5μmol/L Lactacystin作用24h,MTT法检测细胞存活率,筛选适宜的含药血清浓度及作用时间。5.实验细胞处理:分以下五组进行实验,正常对照组、模型组、吐温组、塞来昔布组、独活香豆素组均选定终浓度15%大鼠血清DMEM,对神经元样PC12细胞预保护24h后,除正常对照组外,其余各组均加入浓度为5μmol/L的Lactacystin,37℃、5%CO2培养箱内作用24h后,留作后续进行指标检测。6.指标检测及统计学处理:应用MTT法检测各组细胞活性;应用ELISA法检测各组细胞上清液中hs-CRP和MMP-9蛋白表达情况。所有实验数据均采用SPSS 25.0软件进行统计学分析,以P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.实验药物浓度及作用时间的确定1.1造模药Lactacystin的浓度确定MTT法检测的吸光度值结果显示,OD值随着Lactacystin浓度逐渐增加呈降低趋势,抑制细胞活性存在显著的剂量依赖性。当Lactacystin浓度为10%μmol/L或超过这一浓度时,细胞增值率显著降低,细胞增殖被显著抑制。因此,选择浓度为5%μmol/L Lactacystin,作用时间24h为建立帕金森病细胞模型的刺激条件。1.2含药血清作用浓度和时间的确定当作用浓度与作用时间相同时,模型组和吐温组的细胞OD值与相对存活率,均无统计学差异(P>0.05)。除20%正常对照组OD值与相对存活率高于空白对照组,余各浓度各时间含药血清组的OD值与相对存活率均低于空白对照组(p<0.01)。作用时间为24h、48h时,15%浓度正常对照组细胞相对存活率分别为96.96%、97.99%,均最接近于空白对照组(p<0.01)。考虑科研实验更加高效化、更加节约化,最终选择各组含药血清的浓度为15%,保护24h为神经元样PC12细胞的保护条件。2.各组含药血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞活性的影响神经元样PC12细胞在予以确定浓度和作用时间的含药血清和造模药物干预后,应用MTT法检测其细胞活性,结果显示:独活香豆素组细胞OD值略低于正常对照组(p<0.01),高于塞来昔布组、模型组及吐温组(p<0.01);塞来昔布组细胞OD值低于正常对照组、独活香豆素组(p<0.01),高于模型组和吐温组(p<0.01);模型组与吐温组OD值之间无统计学差异(p>0.05),且细胞OD值明显低于正常对照组、独活香豆素组、塞来昔布组(p<0.01)。提示:与正常对照组相比,模型组及吐温组对细胞活性有损伤,模型复制成功,且吐温组无神经保护作用;与模型组及吐温组相比,独活香豆素和塞来昔布对细胞活性均有明显保护作用,而且独活香豆素的保护作用优于塞来昔布。3.各组含药血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中hs-CRP蛋白水平表达的影响神经元样PC12细胞在予以确定浓度和作用时间的含药血清和造模药物干预后,应用ELISA法检测其细胞上清液hs-CRP的含量,结果显示:独活香豆素组细胞上清液hs-CRP蛋白的含量略高于正常对照组(p<0.01),低于塞来昔布组、模型组及吐温组(p<0.01);塞来昔布组细胞上清液hs-CRP蛋白的含量高于正常对照组、独活香豆素组(p<0.01),低于模型组和吐温组(p<0.01);模型组与吐温组间细胞上清液hs-CRP蛋白的含量无统计学差异(p>0.05),且均高于正常对照组、独活香豆素组、塞来昔布组(p<0.01)。4.各组含药血清对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞上清液中MMP-9蛋白水平表达的影响神经元样PC12细胞在予以确定浓度和作用时间的含药血清和造模药物干预后,应用ELISA法检测其细胞上清液MMP-9的含量,结果显示:独活香豆素组细胞上清液MMP-9蛋白的含量略高于正常对照组(p<0.01),低于塞来昔布组、模型组及吐温组(p<0.01);塞来昔布组细胞上清液MMP-9蛋白的含量高于正常对照组、独活香豆素组(p<0.01),低于模型组和吐温组(p<0.01);模型组与吐温组间细胞上清液MMP-9蛋白的含量无统计学差异(p>0.05),且均高于正常对照组、独活香豆素组、塞来昔布组(p<0.01)。结论:1.蛋白酶体抑制剂Lactacystin作为造模药,成功建立神经元样PC12细胞PD模型。最适宜的造模条件是浓度为5%μmol/L Lactacystin,作用时间24h。模型复制成功后,神经元样PC12细胞活性下降,细胞上清液中炎症因子hs-CRP、MMP-9蛋白的表达升高。2.独活香豆素对Lactacystin诱导建立的PD模型细胞的最佳保护条件:独活香豆素含药血清浓度为15%、作用时间为24h。独活香豆素含药血清能够提高PD模型细胞相对存活率,效果优于塞来昔布,独活香豆素助溶剂吐温80对细胞无保护作用。3.独活香豆素具有抑制神经炎症作用。独活香豆素含药血清可能是通过下调PD模型细胞上清液中炎症因子hs-CRP、MMP-9的表达,抑制Lactacystin诱导的PD模型细胞的炎症反应,进而对Lactacystin诱导的神经元样PC12细胞起到保护作用。