目的:本实验采用体内外实验相结合的方法,以补中益气汤为培土生金法代表方剂,研究其对顺铂耐药细胞株A549/DDP及其荷瘤裸鼠体内P糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)和肺耐药相关蛋白(lung resistance-related protein,LRP)表达的影响,以期能为培土生金法影响肺癌耐药的机制提供相关实验依据。材料与方法:分别设计并合成针对P-gp、LRP基因的三组si RNA序列(si RNA1、si RNA2和si RNA3),采用转染试剂对细胞进行转染,两种蛋白实验均采用人肺腺癌耐顺铂A549/DDP细胞,实验分组为:空白对照组(10%胎牛血清)、si RNA1组(10%胎牛血清+si RNA序列1质粒)、si RNA2组(10%胎牛血清+si RNA序列2质粒)和si RNA3组(10%胎牛血清+si RNA序列3质粒)。计算转染率,荧光定量PCR(Quantitative Real-time PCR,QRT-PCR)筛选沉默率高的si RNA序列用于后续实验。将SD大鼠置于动物室中,适应性饲养后,按随机数字表将20只大鼠分为两组,每组10只:空白对照组(予生理盐水灌胃,2 m L),CQD组(予补中益气汤灌胃,2 m L),日灌胃1次,连续7 d。末次给药1 h后,真空采血器取血,静置后离心,水浴锅灭活。分别用补中益气汤含药血清及不同si RNA转染处理A549/DDP细胞,两种蛋白实验分组均为:空白对照组(10%空白鼠血清)、补中益气汤(Center-Supplementing and Qi-Boosting Decoction,CQD)组(10%补中益气汤含药血清)及si RNA处理组(10%空白鼠血清+最佳沉默si RNA序列质粒)。采用QRT-PCR检测P-gp及LRP m RNA表达,免疫细胞化学法检测蛋白表达及定位,蛋白质印迹法检测蛋白表达。BALB/c裸鼠72只,按照随机数字表随机分成4组,每组18只(雌雄各半),分组为:A549对照组、空白对照组、DDP组和CQD组。A549对照组裸鼠于后背皮下注射处于对数生长期的2×108/L A549细胞悬液0.2 m L,空白对照组、DDP组和CQD组裸鼠于后背皮下注射处于对数生长期的2×108/L A549/DDP细胞悬液0.2 m L,一周造模成功后,A549对照组和空白对照组:生理盐水灌胃,0.5 m L/只,日2次,连续21 d;DDP组:顺铂腹腔注射,l.38 mg/m2,日1次,连续3 d;CQD组:补中益气汤灌胃,0.5 m L/只,日2次,连续21 d;分别于给药后7 d、14 d、21 d每组取6只裸鼠脱颈处死,剥离实体瘤、脾脏,采用QRT-PCR检测P-gp及LRP m RNA表达,免疫组织化学法检测蛋白表达及定位,蛋白质印迹法检测蛋白表达。采用Microsoft Excel 2013对数据进行整理,SPSS19.0统计学软件对数据进行分析,实验数据以均数±标准差(X±s)表示,组间均数比较采用单因素方差分析,定义P<0.05为差异有统计学意义。结果:1.P-gp si RNA在A549/DDP细胞的转染效率为(84.34±4.55)%,LRP si RNA在A549/DDP细胞的转染效率为(73.62±7.92)%。效果最优的P-gp si RNA转染细胞后,沉默率为99.34%,效果最优的LRP si RNA转染细胞后,沉默率为85.41%,分别同阴性干扰组相比差异具有统计学意义(P<0.05)。2.采用QRT-PCR技术检测P-gp及LRP m RNA表达,在CQD组及si RNA处理组中m RNA表达明显低于空白对照组(P<0.05),差异具有统计学意义;且CQD组同si RNA处理组差异没有统计学意义(P>0.05)。3.免疫细胞化学法及蛋白质印迹法检测P-gp及LRP蛋白在CQD组及si RNA处理组中表达明显低于空白对照组(P<0.05),差异具有统计学意义;且CQD组同si RNA处理组差异没有统计学意义(P>0.05)。4.采用QRT-PCR技术检测P-gp及LRP m RNA在荷瘤裸鼠实体瘤上表达,数据显示7 d时,同空白对照组相比,CQD组和DDP组P-gp及LRP m RNA表达没有区别(P>0.05)。从14 d开始,同空白对照组相比,单纯使用DDP化疗的裸鼠P-gp及LRP m RNA表达明显增高(P<0.05),而使用补中益气汤的裸鼠P-gp及LRP m RNA表达下降(P<0.05),随着时间推移,效果逐渐明显。在14 d和21 d时,同正常非耐药细胞A549荷瘤裸鼠实体瘤对比,CQD组P-gp及LRP m RNA表达没有区别(P>0.05)。14 d时CQD组同7 d时CQD组比较,P-gp和LRP m RNA表达没有区别(P>0.05),21 d时CQD组同14 d时CQD组比较,P-gp和LRP m RNA表达明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。5.免疫细胞化学法及蛋白质印迹法检测P-gp及LRP蛋白在荷瘤裸鼠实体瘤上表达,数据显示7 d时,同空白对照组相比,CQD组和DDP组P-gp及LRP蛋白表达没有区别(P>0.05)。从14 d开始,单纯使用DDP化疗的裸鼠P-gp及LRP蛋白表达明显增高(P<0.05),而使用补中益气汤的裸鼠P-gp及LRP蛋白表达开始下降(P<0.05),随着时间推移,效果逐渐明显,与m RNA效果类似。在14 d和21 d时,同正常非耐药细胞A549荷瘤裸鼠实体瘤对比,CQD组P-gp及LRP蛋白表达没有区别(P>0.05)。14 d时CQD组同7 d时CQD组比较,P-gp和LRP蛋白表达没有区别(P>0.05),21 d时CQD组同14 d时CQD组比较,P-gp和LRP蛋白表达明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。6.采用QRT-PCR技术检测P-gp及LRP m RNA在荷瘤裸鼠脾脏上表达,数据显示7 d、14 d和21 d时,同空白对照组相比,CQD组P-gp m RNA表达减少(P<0.05);CQD组同A549对照组相比P-gp m RNA表达没有区别(P>0.05)。7 d时CQD组和DDP组LRP m RNA表达没有区别(P>0.05)。从14 d开始,同空白对照组相比,单纯使用DDP化疗的裸鼠LRP m RNA表达明显增高(P<0.05),而使用补中益气汤的裸鼠LRP m RNA表达开始下降(P<0.05)。在14 d和21 d时,同正常非耐药细胞A549荷瘤裸鼠脾脏对比,CQD组P-gp及LRP m RNA表达没有区别(P>0.05)。7 d、14 d和21 d时CQD组两两比较,P-gp m RNA表达没有区别(P>0.05);14 d时CQD组同7 d时CQD组比较,LRP m RNA表达没有区别(P>0.05),21 d时CQD组同14 d时CQD组比较,LRP m RNA表达明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。7.免疫细胞化学法及蛋白质印迹法检测P-gp及LRP蛋白在荷瘤裸鼠脾脏上表达,数据显示7 d、14 d和21 d时,同空白对照组相比,CQD组P-gp蛋白表达减少(P<0.05);CQD组同A549对照组相比P-gp蛋白表达没有区别(P>0.05)。7 d时CQD组和DDP组LRP蛋白表达没有区别(P>0.05)。从14 d开始,同空白对照组相比,单纯使用DDP化疗的裸鼠LRP蛋白表达明显增高(P<0.05),而使用补中益气汤的裸鼠LRP蛋白表达开始下降(P<0.05)。在14 d和21 d时,同正常非耐药细胞A549荷瘤裸鼠脾脏对比,CQD组P-gp及LRP蛋白表达没有区别(P>0.05)。7 d、14 d和21 d时CQD组两两比较,P-gp蛋白表达没有区别(P>0.05);14 d时CQD组同7 d时CQD组比较,LRP蛋白表达没有区别(P>0.05),21 d时CQD组同14 d时CQD组比较,LRP蛋白表达明显降低,具有统计学意义(P<0.05)。结论:1.补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞的P-gp及LRP m RNA表达有下调作用,该作用效果同si RNA作用效果类似。补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞的P-gp及LRP蛋白表达有下调作用,该作用效果可能是通过下调P-gp及LRP m RNA实现的。2.补中益气汤对A549/DDP瘤组织中P-gp和LRP m RNA表达有时间依赖性下调作用,基因下调后表达水平同非耐药细胞A549瘤组织中P-gp和LRP m RNA表达水平类似。该方对A549/DDP瘤组织中P-gp和LRP蛋白表达有时间依赖性下调作用,该作用效果可能通过下调P-gp和LRP m RNA实现的。3.补中益气汤对A549/DDP荷瘤裸鼠脾脏P-gp和LRP m RNA表达有下调作用,基因下调后表达水平同非耐药细胞A549荷瘤裸鼠脾脏P-gp和LRP m RNA表达水平类似。该方对A549/DDP荷瘤裸鼠脾脏P-gp和LRP蛋白表达有下调作用,该作用效果可能通过下调P-gp及LRP m RNA实现的。对A549/DDP荷瘤裸鼠脾脏P-gp m RNA和蛋白表达的下调作用,并无时间依赖性。对A549/DDP荷瘤裸鼠脾脏LRP m RNA和蛋白表达的下调作用,具有时间依赖性。