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目的由于人口老龄化的原因,神经退行性疾病的发病率和致残率越来越高,在社会经济方面产生了相当大的影响,越来越多的证据表明,帕金森病(PD)、阿尔茨海默病(AD)和肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)等神经退行性疾病的发病机制不仅涉及到神经元,而且还与中枢神经系统(CNS)的免疫反应有很大的关系,特别是小胶质细胞.本文旨在探讨受体拮抗剂5-BDBD对小胶质细胞中NLRP3炎性小体活化的影响。方法取处于对数生长期的BV2小胶质细胞用于实验,采用脂多糖(LPS)+三磷酸腺苷(ATP)双信号干预,建立NLRP3炎性小体活化的模型。按照不同干预方法将BV2小胶质细胞分为8组:正常对照组、ATP组、LPS组、LPS+ATP组、5-BDBD组、ATP+5-BDBD组、LPS+5-BDBD组和LPS+ATP+5-BDBD组。应用CCK-8法检测LPS和ATP对BV2细胞活力的影响,以为后续实验选取适宜的药物浓度;Real time PCR检测各组NLRP3、P2X4 mRNA表达水平;Western blot技术测定P2X4、NLRP3、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(caspase-1)的蛋白表达水平;酶联免疫吸附法(ELISA)法测定细胞上清液中IL-1β释放水平。结果如下:1.CCK-8的结果显示1μg/m L的LPS以及0-1mmol/L的ATP浓度均不影响BV2细胞的活力(P>0.05),而2mmol/L以上的ATP浓度则对BV2细胞的存活率产生影响,我们选取的2mmol/L、3mmol/L、5mmol/L的ATP浓度组BV2细胞的活力均较对照组偏低,差异均具有统计学意义(P<0.05,P<0.001,P<0.001)。虽然2mmol/L的ATP浓度对细胞出现了损伤作用,影响了细胞的活力(79.52±3.873%),但是通过我们后续的预试验以及阅读大量文献,证明2mmol/L以下的ATP浓度和LPS共同作用不能很好的激活下游通路,而2mmol/L的ATP和1μg/mL的LPS具有较好的相容性,也能很好的激活其下游通路,因此,我们选取了1μg/mL的LPS、2mmol/L的ATP作为后续实验的药物浓度。2.Real time PCR结果显示,与对照组相比较,LPS组和LPS+ATP组的NLRP3mRNA水平均明显增高,差异均具有统计学意义(P<0.001,P<0.001),并且与LPS组相比,LPS+ATP组的NLRP3 mRNA水平升高,差异有统计学意义(P<0.05);和对照组相比较,加入2mmol/L的ATP处理BV2细胞3 h后,其P2X4 mRNA表达明显增加,差异具有显著统计学意义(P<0.001)。3.Western blot检测结果表明,与对照组相比,在加入2mmol/L的ATP处理3 h后,BV2细胞中的P2X4蛋白表达明显增加,差异有显著统计学意义(P<0.001);和对照组相比,LPS+ATP双信号处理BV2细胞后NLRP3蛋白水平明显升高,差异具有统计学意义(P<0.001),而单独用LPS或ATP处理的BV2细胞中NLRP3蛋白水平与对照组相比没有统计学意义(P>0.05);和对照组比较,LPS组和ATP组中caspase-1(P10)蛋白水平的变化没有统计学意义(P>0.05),LPS+ATP组的caspase-1(P10)蛋白表达水平明显增加,差异有统计学意义(P<0.001),但是在加入P2X4受体拮抗剂5-BDBD后结果提示,LPS+ATP+5-BDBD组的caspase-1(P10)蛋白表达水平较LPS+ATP组明显减少,差异有统计学意义(P<0.001)。4.用ELISA法检测各组细胞上清液中IL-1β的含量,结果提示,与对照组相比,LPS组和ATP组上清液中IL-1β含量的变化没有统计学意义(P>0.05),LPS+ATP双信号处理BV2细胞后,上清液中IL-1β的含量显著增加,差异有统计学意义(P<0.01),但是在加入P2X4受体拮抗剂5-BDBD后结果提示,与LPS+ATP组相比较,LPS+ATP+5-BDBD组上清液中IL-1β的含量明显减少,差异有统计学意义(P<0.05)。结论P2X4受体拮抗剂5-BDBD能够抑制LPS+ATP双信号激活BV2细胞中NLRP3炎性小体后的炎性效应,包括caspase-1(P10)的活化及IL-1β的的产生,这将为神经退行性疾病的抗炎治疗提供新的思路。