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汞是一种广泛存在于自然环境中的有剧毒的重金属污染物,主要以单质汞、无机汞和有机汞三种形式存在。氯化汞（Mercuric chloride,HgCl2）由于其难以降解,且容易在肾脏中累积并造成损伤而被广泛关注。程序性细胞死亡（Programmed cell death,PCD）是由基因控制、机体自主调控的一类细胞死亡方式。其中,凋亡作为最早被揭示的PCD模式,长期以来一直被认为是重金属导致器官毒性的主要机制。近几年一些新的PCD模式被陆续发现,包括铁死亡和程序性坏死,并被证实在多种重金属所致的毒性机制中同样发挥着重要作用,提示重金属的毒性作用可能是几种PCD共同介导的。并且值得注意的是,目前大多对HgCl2导致肾毒性机制的研究还局限于凋亡等单一的死亡方式,对于铁死亡和程序性坏死是否以及如何参与HgCl2诱导的肾损伤还未被揭示。本课题以铁自噬引发的铁紊乱为切入点,建立HgCl2暴露原代鸡胚肾细胞（Chicken embryonic kidney,CEK）的损伤模型,旨在深入探讨HgCl2暴露致鸡肾脏损伤中程序性坏死与铁死亡的交互作用。在体外培养CEK细胞后,经不同浓度（0、10、15、20和25μM）HgCl2处理12h或24 h,通过检测细胞存活率以确定HgCl2最适染毒浓度为15μM。使用共聚焦显微镜观察凋亡特异性探针（YO-PRO）染色,结合蛋白免疫印迹检测凋亡标志蛋白（包括Bcl-2、Bax）以及凋亡特异性抑制剂（Z-VAD-FMK,z VAD）对细胞存活率的影响。结果表明,凋亡不是HgCl2导致CEK细胞死亡的主要原因。使用共聚焦显微镜观察Hoechst33342和PI染色后细胞形态,发现HgCl2呈时间依赖性增加PI阳性细胞比率,结合LDH的释放率同样呈时间依赖性增加的结果,提示HgCl2暴露可能导致CEK细胞发生坏死。由于程序性坏死在肾损伤中的作用被广泛报道,因此首先探究CEK细胞中是否发生了程序性坏死。通过蛋白免疫印迹法检测程序性坏死标志蛋白（包括RIPK1、RIPK3、MLKL和p-MLKL）,同时结合程序性坏死特异性抑制剂（Necrostatin-1,Nec-1）,检测细胞存活率和LDH的释放率。结果表明,HgCl2暴露24 h后CEK细胞发生了程序性坏死,但在12 h并未被激活,提示可能存在其他形式的死亡方式参与。由于铁死亡的细胞形态也表现出坏死特征,因此下一步对铁死亡进行了研究。使用铁死亡特异性抑制剂（Ferrostatin-1,Fer-1）处理细胞,采用蛋白免疫印迹法检测铁死亡关键调节蛋白GPX4,结合细胞存活率和LDH的释放率的检测。结果表明,铁死亡在HgCl2暴露12 h后被激活,而程序性坏死在暴露24 h后被激活。ROS是铁死亡和程序性坏死的共同诱因,因此推测ROS可能在铁死亡和程序性坏死的顺序激活中起到了关键作用。通过共聚焦显微镜观察ROS探针（DCFA-DA）的荧光强度,结合ROS清除剂（N-acetylcysteine,NAC）对细胞活力的影响,结果表明,ROS是HgCl2诱发CEK细胞中铁死亡和程序性坏死发生的始动因素。鉴于游离铁能够通过芬顿（Fenton）反应生成ROS,这是铁死亡的关键诱因,因而检测细胞中铁水平。检测细胞总铁含量、不稳定铁池（Labile iron pool,LIP）水平,以及铁螯合剂去铁胺（Deferoxamine,DFO）对ROS水平、细胞活力、LIP水平以及铁死亡和程序性坏死标志蛋白的影响。结果表明,HgCl2通过铁依赖的方式持续堆积ROS来触发两种死亡模式的顺序激活。鉴于LIP与铁代谢密切相关,下一步对CEK细胞中铁代谢进行了深入研究。采用蛋白免疫印迹法检测铁代谢标志蛋白（包括FBXL5、IREB2、TFRC、FPN1、FTH和FTL）,结果表明,HgCl2暴露导致CEK细胞铁超载,并降低细胞内铁储存能力。铁自噬是铁蛋白选择性降解的重要途径,在铁代谢中同样起着重要作用,鉴于结果发现细胞铁吸收和排出正常,故进一步探讨铁自噬途径。采用蛋白免疫印迹法检测铁自噬标志蛋白（包括NCOA4、ATG5、ATG7和LC3）,结合免疫荧光结合共聚焦显微技术检测LC3和FTH的共定位情况,发现HgCl2暴露激活CEK细胞中铁自噬。最后,结合自噬抑制剂（Chloroquine,CQ）对细胞活力、铁自噬、铁死亡和程序性坏死标志蛋白的影响,证实HgCl2暴露通过铁自噬介导CEK细胞中铁死亡和程序性坏死的顺序激活。综上所述,HgCl2通过激活CEK细胞中铁自噬,降解细胞中铁蛋白以释放过量的游离铁,导致ROS持续堆积,并最终触发铁死亡和程序性坏死的顺序激活。本研究为HgCl2的肾毒性机制研究开拓新的思路,对不同类型的程序性细胞死亡方式在重金属所致的肾损伤的机制提供了全新的理论依据。