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研究目的:创伤性脑损伤(Traumatic brain injury,TBI)是是全球范围内的致死及致残的主要疾病之一,积极探索TBI后神经功能损伤的发病机制,始终是TBI研究的重点。自噬是一种生物进化保守的细胞内溶酶体降解过程,通过自噬可以清除错误折叠的有害蛋白,降解受损的或多余的细胞器等,进而维持细胞内环境稳态,目前越来越多研究表明,TBI后神经元中存在自噬水平的上调,这种激活的自噬可能对TBI后神经功能损伤发挥重要的调控作用。外泌体是一类可由各种细胞在体内外分泌的具有生物活性的膜性小泡。外泌体可作为载体在细胞间传递功能性物质,从而在生理过程及不同疾病的病理过程中发挥作用。我所在课题组前期通过miRNA微阵列芯片杂交技术发现了TBI后小胶质细胞外泌体中miR-124-3p水平的增高。而miR-124-3p具备潜在的调控自噬的可能。因此,本实验将主要通过对TBI体内外模型的进行研究,阐明高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体调控TBI后神经元自噬的作用机制,以及对TBI后神经功能损伤的影响。为探索应用外泌体及miRNA治疗TBI的新策略提供理论依据。方法:1.建立rTBI小鼠模型并使用不同时期的rTBI小鼠模型脑组织匀浆刺激体外培养的BV2小胶质细胞系以模拟伤后急性、慢性期小胶质细胞周围环境。应用超速离心技术分离提取小胶质细胞外泌体。应用透射电镜、外泌体标志蛋白检测和Nano sight技术对外泌体进行鉴定。应用qRT-PCR技术,检测TBI后不同时间点小胶质细胞及小胶质细胞外泌体中miR-124-3p的表达变化。2.培养HT-22神经元细胞系,通过划痕实验建立TBI体外模型。通过自噬抑制剂氯喹外源性调节神经元自噬,应用Western Blot技术测定自噬标志蛋白及凋亡相关蛋白的表达变化,应用共聚焦成像技术测定免疫荧光染色的自噬标志蛋白LC3的表达变化,以评价TBI后神经元自噬的激活情况,以及神经元自噬对TBI后神经元凋亡的影响。3.应用脂质体转染技术外源性调控相关基因的表达;并应用Western Blot技术检测自噬标志蛋白及凋亡相关蛋白表达水平的变化;从而评价高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体对TBI后神经元自噬的调控作用,以及对伤后神经元凋亡的影响。应用生物信息分析技术,预测miR-124-3p调控自噬的可能靶基因,并应用荧光素酶报告实验和基因沉默/回补实验,验证小胶质细胞外泌体中的miR-124-3p通过作用于相关靶基因进而调控神经元自噬。应用尾静脉注射技术及神经功能评价方法(mNSS、转杆实验、水迷宫实验),进一步体内探讨高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体对TBI后神经功能及认知功能损伤的影响。结果:1.(1)通过超速离心方法,提取了体外培养的小胶质细胞来源的外泌体,并通过透射电镜、标志蛋白检测和Nano sight技术鉴定外泌体提取成功。(2)通过对接受rTBI小鼠脑组织匀浆刺激的小胶质细胞及其来源外泌体中的总RNA进行RT-PCR检测,结果提示,rTBI伤后不同时间点(3d,7d,14d,21d)提取的脑组织匀浆刺激BV2小胶质细胞后,小胶质细胞中miR-124-3p的表达量较空白对照组均显著升高,且先逐渐升高,并于14天达到最高峰,随后21天略微下降。在小胶质细胞外泌体中,miR-124-3p表达量出现了相同的变化趋势。2.(1)对划痕损伤后HT22中的自噬和凋亡相关蛋白进行检测,结果发现划痕损伤后可以诱导HT22神经元自噬的激活,并加重神经元的凋亡损伤。(2)应用氯喹对划痕损伤诱导的神经元自噬进行抑制后,对HT22神经元中的自噬和凋亡蛋白进行检测,结果发现随着伤后后神经元自噬水平的下降,神经元凋亡程度减轻;表明抑制划痕损伤激活的神经元自噬可以减轻神经元凋亡。3.(1)通过高表达miR-124-3p的小胶质细胞与划痕损伤的神经元进行共培养,发现高表达miR-124-3p的小胶质细胞可抑制神经元自噬、减轻凋亡损伤;并利用GW4869抑制外泌体分泌,证实了小胶质细胞外泌体是发挥上述作用的关键。(2)通过外源性调控小胶质细胞外泌体中miR-124-3p的水平,证实小胶质细胞外泌体主要通过其转运的miR-124-3p对神经元自噬产生抑制作用。(3)通过靶基因预测和荧光素酶报告实验,证实了FIP200为miR-124-3p的自噬相关靶基因,miR-124-3p可通过靶向抑制FIP200进而对TBI后神经元自噬进行调控。(4)通过基因沉默/基因回补实验,进一步确认miR-124-3p可以靶向抑制FIP200介导的神经元自噬,从而对TBI模型神经元中发挥保护作用。(5)通过对rTBI小鼠模型尾静脉注射高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体,初步发现高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体可以改善rTBI小鼠的神经功能损伤、促进学习能力及记忆功能恢复。结论:1.TBI后,小胶质细胞来源的外泌体中miR-124-3p的表达量增加,这种增加可从TBI伤后急性期持续到慢性期(伤后21天)。2.TBI可导致神经元自噬过度激活;抑制TBI后过度激活的神经元自噬可以减轻神经元损伤。3.高表达miR-124-3p的小胶质细胞可以通过其分泌的外泌体抑制TBI后的神经元自噬,减轻神经元损伤。4.高表达miR-124-3p小胶质细胞外泌体主要通过其转运的miR-124-3p对TBI诱导的神经元自噬产生抑制作用。5.miR-124-3p通过靶向抑制FIP200进而对TBI后神经元自噬进行调控。6.尾静脉注射高表达miR-124-3p的小胶质细胞外泌体可以改善rTBI小鼠神经功能损伤,促进认知功能恢复,为TBI的治疗提供了一种有前景的治疗策略。