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研究背景与目的
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球发病率第3和死亡率第4的肿瘤，2018年新增病例近200万，死亡人数近100万。目前主要的治疗方法为腹腔镜手术、化疗、放疗等，但其对治愈率和长期生存率的影响有限，急需开发新的治疗方案。肥胖、缺乏运动、饮酒、吸烟等已被确定为结直肠癌发生的危险因素。此外，基因结构的异常也是结直肠癌发生的一个重要原因。结直肠癌中除了存在APC、K-Ras等原癌基因以及p53等抑癌基因的突变外，一个重要的特征是其存在较大比例的微卫星不稳定性(microsatelliteinstability, MSI)。微卫星不稳定性导致结直肠癌更容易积累突变，更易产生能够被免疫系统识别的新抗原，也使结直肠癌患者对免疫疗法有很好的反应。
溶瘤病毒具有能选择性在肿瘤细胞内复制裂解肿瘤细胞、引起机体抗肿瘤免疫等特性而成为近年来很有潜力的肿瘤免疫治疗新方法。溶瘤病毒以多形式多途径与机体免疫系统相互作用，改善肿瘤免疫微环境，增强免疫细胞的浸润，激活肿瘤特异性免疫反应。抗肿瘤免疫的活化是溶瘤病毒发挥疗效的一个重要方面，也是溶瘤病毒疗法相比手术、化疗和放疗的一个显著优势。肿瘤免疫的活化不但对不能手术的肿瘤灶有作用，而且还可以作用于远端转移瘤，有效的防止肿瘤的复发。目前已有3种溶瘤病毒获批用来治疗肿瘤，包括用于治疗含黑色素瘤在内的多种癌症的Rigvir、治疗晚期头颈部肿瘤的Oncorine(H101)以及治疗黑色素瘤的talimogenelaherparepvec(T-Vec)。
溶瘤痘苗病毒作为治疗肿瘤的一种很有潜力的制剂，在过去的20多年里得第2部分溶瘤痘苗病毒治疗结直肠癌细胞系CMT93皮下瘤机制的研究
目的
研究溶瘤痘苗病毒治疗CMT93皮下瘤潜在作用机制。
方法
1.建立CMT93皮下瘤模型，待小鼠皮下瘤平均体积长到150mm3时随机分为3组，使每组小鼠肿瘤平均体积相同，分组当天记为D1天。D1、D3、D5天分别用PBS100μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP1×108PFU/100μL/鼠、VVΔTKΔN1L-mIL211×108PFU/100μL/鼠对3组小鼠进行治疗。
2.D7、D14、D20天，随机取各实验组小鼠3只，收集其淋巴结、脾脏、皮下瘤、血清。
3.组化检测皮下瘤冰冻切片CD4+T、CD8+T的浸润，检测痘苗病毒衣壳蛋白、检测mIL21蛋白。
4.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞以及NK细胞的改变。
5.IFN-γ释放实验检测不同实验组小鼠脾细胞对肿瘤细胞及病毒肽的反应。
结果
1.病毒治疗3次后，D20天，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗部分清除CMT93皮下瘤(2/3)。
2.病毒治疗后，改变了CMT93皮下瘤微环境，两病毒治疗组与PBS组相比，皮下瘤组织CD4+T和CD8+T细胞的浸润显著增加。
3.病毒治疗后D7天，VVΔTKΔN1L-mIL21相比VVΔTKΔN1L-RFP和PBS组，其脾脏CD4+T细胞占CD3+T细胞比例显著下降，同时CD8+T所占比例显著升高，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改变了小鼠脾细胞CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例。
4.病毒治疗后D7天，两病毒治疗组脾脏Tem-CD4和Tem-CD8均显著高于PBS组；第14天和第20天，VVΔTKΔN1L-mIL21相比VVΔTKΔN1L-RFP和PBS组，其脾脏Tcm-CD8显著升高。
5.病毒治疗后第20天，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗组小鼠相比PBS组，CMT93-MMC、B8R刺激小鼠脾细胞后分泌的IFN-γ显著升高。
结论
VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改善了皮下瘤免疫微环境，促进脾脏免疫记忆细胞的形成。
第3部分溶瘤痘苗病毒治疗结肠癌细胞系CT26肝转移瘤及其机制的研究
目的
研究溶瘤痘苗病毒经静脉注射到达远端肿瘤的能力及对CT26转移瘤的治疗效果和潜在机制。
方法
1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型，模型建立后第5、7、9天肝组织HE染色检测确定CT26肿瘤细胞有无肝部定植，模型建立后3、4、5周B超检测肿瘤肝部生长情况。
2.建立CT26肝转移模型，模型建立当天记为D0天，并于D7、D9、D11、D21、D23、D25分别用PBS125μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21各2×108PFU/125μL/鼠进行治疗。统计各组小鼠生存时间，绘制小鼠生存曲线。
3.建立CT26肝转移模型，模型建立当天记为D0天，并与D7、D9、D11对各组小鼠进行治疗，D14、D18天分别收集各组小鼠肝脏、脾、淋巴结、血清、血液等进行各指标检测。
4.组化检测小鼠肝脏组织冰冻切片CD4+T、CD8+T浸润，检测痘苗病毒衣壳蛋白。
5.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群比例的变化。
6.ELISA检测小鼠血清mIL21的含量。
结果
1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型很稳定。
2.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒相比PBS治疗CT26肝转移，均取得很好的疗效，延缓肿瘤的发展。
3.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒能够通过血液循环达到肝部肿瘤发挥溶瘤作用。
4.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒的治疗重塑了CT26肝转移肿瘤的微环境，促进CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润，小鼠淋巴结和脾脏T细胞亚群发生改变。
结论
VVΔTKΔN1L-mIL21能够通过血液循环到达肝部肿瘤发挥作用，延缓CT26转移瘤的发展，重塑CT26肝转移肿瘤的微环境。
结直肠癌(Colorectal cancer, CRC)是全球发病率第3和死亡率第4的肿瘤，2018年新增病例近200万，死亡人数近100万。目前主要的治疗方法为腹腔镜手术、化疗、放疗等，但其对治愈率和长期生存率的影响有限，急需开发新的治疗方案。肥胖、缺乏运动、饮酒、吸烟等已被确定为结直肠癌发生的危险因素。此外，基因结构的异常也是结直肠癌发生的一个重要原因。结直肠癌中除了存在APC、K-Ras等原癌基因以及p53等抑癌基因的突变外，一个重要的特征是其存在较大比例的微卫星不稳定性(microsatelliteinstability, MSI)。微卫星不稳定性导致结直肠癌更容易积累突变，更易产生能够被免疫系统识别的新抗原，也使结直肠癌患者对免疫疗法有很好的反应。
溶瘤病毒具有能选择性在肿瘤细胞内复制裂解肿瘤细胞、引起机体抗肿瘤免疫等特性而成为近年来很有潜力的肿瘤免疫治疗新方法。溶瘤病毒以多形式多途径与机体免疫系统相互作用，改善肿瘤免疫微环境，增强免疫细胞的浸润，激活肿瘤特异性免疫反应。抗肿瘤免疫的活化是溶瘤病毒发挥疗效的一个重要方面，也是溶瘤病毒疗法相比手术、化疗和放疗的一个显著优势。肿瘤免疫的活化不但对不能手术的肿瘤灶有作用，而且还可以作用于远端转移瘤，有效的防止肿瘤的复发。目前已有3种溶瘤病毒获批用来治疗肿瘤，包括用于治疗含黑色素瘤在内的多种癌症的Rigvir、治疗晚期头颈部肿瘤的Oncorine(H101)以及治疗黑色素瘤的talimogenelaherparepvec(T-Vec)。
溶瘤痘苗病毒作为治疗肿瘤的一种很有潜力的制剂，在过去的20多年里得第2部分溶瘤痘苗病毒治疗结直肠癌细胞系CMT93皮下瘤机制的研究
目的
研究溶瘤痘苗病毒治疗CMT93皮下瘤潜在作用机制。
方法
1.建立CMT93皮下瘤模型，待小鼠皮下瘤平均体积长到150mm3时随机分为3组，使每组小鼠肿瘤平均体积相同，分组当天记为D1天。D1、D3、D5天分别用PBS100μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP1×108PFU/100μL/鼠、VVΔTKΔN1L-mIL211×108PFU/100μL/鼠对3组小鼠进行治疗。
2.D7、D14、D20天，随机取各实验组小鼠3只，收集其淋巴结、脾脏、皮下瘤、血清。
3.组化检测皮下瘤冰冻切片CD4+T、CD8+T的浸润，检测痘苗病毒衣壳蛋白、检测mIL21蛋白。
4.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群、巨噬细胞、树突细胞以及NK细胞的改变。
5.IFN-γ释放实验检测不同实验组小鼠脾细胞对肿瘤细胞及病毒肽的反应。
结果
1.病毒治疗3次后，D20天，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗部分清除CMT93皮下瘤(2/3)。
2.病毒治疗后，改变了CMT93皮下瘤微环境，两病毒治疗组与PBS组相比，皮下瘤组织CD4+T和CD8+T细胞的浸润显著增加。
3.病毒治疗后D7天，VVΔTKΔN1L-mIL21相比VVΔTKΔN1L-RFP和PBS组，其脾脏CD4+T细胞占CD3+T细胞比例显著下降，同时CD8+T所占比例显著升高，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改变了小鼠脾细胞CD4+T和CD8+T细胞亚群的比例。
4.病毒治疗后D7天，两病毒治疗组脾脏Tem-CD4和Tem-CD8均显著高于PBS组；第14天和第20天，VVΔTKΔN1L-mIL21相比VVΔTKΔN1L-RFP和PBS组，其脾脏Tcm-CD8显著升高。
5.病毒治疗后第20天，VVΔTKΔN1L-mIL21治疗组小鼠相比PBS组，CMT93-MMC、B8R刺激小鼠脾细胞后分泌的IFN-γ显著升高。
结论
VVΔTKΔN1L-mIL21治疗改善了皮下瘤免疫微环境，促进脾脏免疫记忆细胞的形成。
第3部分溶瘤痘苗病毒治疗结肠癌细胞系CT26肝转移瘤及其机制的研究
目的
研究溶瘤痘苗病毒经静脉注射到达远端肿瘤的能力及对CT26转移瘤的治疗效果和潜在机制。
方法
1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型，模型建立后第5、7、9天肝组织HE染色检测确定CT26肿瘤细胞有无肝部定植，模型建立后3、4、5周B超检测肿瘤肝部生长情况。
2.建立CT26肝转移模型，模型建立当天记为D0天，并于D7、D9、D11、D21、D23、D25分别用PBS125μL/鼠、VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21各2×108PFU/125μL/鼠进行治疗。统计各组小鼠生存时间，绘制小鼠生存曲线。
3.建立CT26肝转移模型，模型建立当天记为D0天，并与D7、D9、D11对各组小鼠进行治疗，D14、D18天分别收集各组小鼠肝脏、脾、淋巴结、血清、血液等进行各指标检测。
4.组化检测小鼠肝脏组织冰冻切片CD4+T、CD8+T浸润，检测痘苗病毒衣壳蛋白。
5.流式分析淋巴结和脾脏中T细胞亚群比例的变化。
6.ELISA检测小鼠血清mIL21的含量。
结果
1.小鼠结肠癌细胞系CT26经脾注射建立肝转移模型很稳定。
2.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒相比PBS治疗CT26肝转移，均取得很好的疗效，延缓肿瘤的发展。
3.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒能够通过血液循环达到肝部肿瘤发挥溶瘤作用。
4.VVΔTKΔN1L-RFP和VVΔTKΔN1L-mIL21病毒的治疗重塑了CT26肝转移肿瘤的微环境，促进CD4+T细胞和CD8+T细胞浸润，小鼠淋巴结和脾脏T细胞亚群发生改变。
结论
VVΔTKΔN1L-mIL21能够通过血液循环到达肝部肿瘤发挥作用，延缓CT26转移瘤的发展，重塑CT26肝转移肿瘤的微环境。